Étiquetage cellules souches avec Ferumoxytol, une nanoparticule approuvé par la FDA d'oxyde de fer

Résumé

Nous décrivons une technique d'étiquetage et de suivi avec des cellules souches approuvé par la FDA, le fer superparamagnétiques d'oxyde (SPIO), ferumoxytol (Feraheme). Cette technique d'imagerie cellulaire qui utilise par résonance magnétique (IRM) pour la visualisation, est facilement accessible pour surveillance à long terme et le diagnostic de succès ou non engraftments cellules souches chez les patients.

Résumé

Thérapies basées sur les cellules souches offrent un potentiel important pour le domaine de la médecine régénérative. Cependant, il reste beaucoup à comprendre sur la cinétique in vivo des cellules transplantées. Une méthode non-invasive pour surveiller de façon répétitive des cellules souches transplantées in vivo permettrait aux enquêteurs de contrôler directement les greffes de cellules souches et de déterminer les résultats greffe réussie ou non.

Une large gamme de cellules souches continue à être étudiée pour des applications innombrables. Ce protocole se concentre sur trois différentes populations de cellules souches: embryonnaires de rein humain 293 (HEK293) les cellules, cellules souches mésenchymateuses humaines (hMSC) et souches pluripotentes induites (iPS). Cellules HEK 293 sont issus de cellules rénales embryonnaires humaines mises en culture par l'adénovirus 5 ADN cisaillé. Ces cellules sont largement utilisés dans la recherche parce qu'ils sont faciles à cultiver, se développent rapidement et sont facilement transfectées. hMSCs sont trouvées dans la moelle adulte. Ces cellules can être reproduits comme des cellules indifférenciées, tout en maintenant multipotence ou le potentiel de se différencier en un nombre limité de destins cellulaires. hMSCs peuvent se différencier pour des lignées de tissus mésenchymateux, y compris les ostéoblastes, les adipocytes, chondrocytes, tendons, muscles, et du stroma médullaire. Les cellules iPS sont des cellules adultes reprogrammées génétiquement qui ont été modifiées pour exprimer des gènes et des facteurs semblables à définir les propriétés des cellules souches embryonnaires. Ces cellules sont pluripotentes sens qu'ils ont la capacité de se différencier en tous les lignages cellulaires ^1. Les deux hMSCs et les cellules iPS ont démontré la capacité de régénération des tissus in vivo.

Par résonance magnétique (IRM) en collaboration avec l'utilisation de l'oxyde de fer superparamagnétiques (SPIO) étiquettes cellulaire des nanoparticules se sont avérées efficaces dans le suivi in vivo des cellules souches en raison de la résolution anatomique microscopiques proximité, une plus longue demi-vie sanguine qui permet d'imagerie longitudinale et la haute SENSIBILITÉy pour la détection de cellules fournies par l'IRM du SPIO nanoparticules ^2-4. En outre, l'IRM avec l'utilisation de SPIOs est cliniquement traduisible. SPIOs sont composées d'un noyau d'oxyde de fer avec une couche de surface de dextrane, carboxydextran ou de l'amidon qui sert à contenir le noyau de fer à partir de composants bioréactifs plasma. Ces agents créent locales inhomogénéités de champ magnétique qui conduisent à une diminution du signal sur les images IRM pondérées en T2 ^5. Malheureusement, SPIOs ne sont plus fabriqués. La deuxième génération, ultrapetites SPIOs (USPIO), cependant, offrir une alternative viable. Ferumoxytol (FerahemeTM) est l'un USPIO composé d'un noyau de magnétite non stœchiométrique entouré d'une couche carboxymethylether sorbitol polyglucose. Le colloïdale, taille des particules de 17-30 nm ferumoxytol est telle que déterminée par diffraction de la lumière. Le poids moléculaire est de 750 kDa, et la relaxivité champ constant à 2T IRM est 58,609 mm-1 sec-1 de force ^4. Ferumoxytol a été récemment approuvé par la FDA unes un supplément de fer pour le traitement de la carence en fer chez les patients atteints d'insuffisance rénale ^6. Notre groupe a appliqué cet agent dans un "hors étiquette" usage pour les applications de marquage cellulaire. Notre technique démontre l'étiquetage efficace des cellules souches avec ferumoxytol qui mène à d'importants effets de signal IRM de cellules marquées sur les images IRM. Cette technique peut être appliquée pour les non-invasif de surveillance de thérapies par cellules souches dans les paramètres pré-cliniques et cliniques.

Protocole

1. Jour 1

Cellules de la plaque 1)

1. HMSC plaque dans une fiole T75 à un confluence de 80% au moins 18-24 heures avant l'étiquetage. Se reporter au Tableau 1 pour les instructions pour les navires de remplacement.

2. Jour 2

2) Préparer une solution d'étiquetage. Cette préparation d'étiquettes un (1) flacon T75 à 80% de confluence avec une concentration de 400 pg Fe / ml. Se reporter au Tableau 1 pour les instructions pour les navires de remplacement.

1. Créer une solution (solution 1) en mélangeant 1 ml de milieu sans sérum et 93,1 l de ferumoxytol (stock: 30 mg / ....

Discussion

Améliorer l'efficacité des cellules souches engraftments est crucial pour l'avancement de la médecine régénérative. Une technique de visualisation non invasive des cellules souches in vivo améliore de façon significative notre capacité à comprendre les mécanismes qui conduisent à des résultats transplantés avec succès. Étiquetage magnétique pour visualiser MR, telles que la procédure, nous avons démontré, permet de suivre in vivo des cellules souches avec l'IRM. Les cellules souche.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Nom du réactif	Société	Numéro de catalogue	Commentaires (optionnel)
D-MEM glycémie élevée	Sigma	D5648	Ou moyen autre base pour la ligne de cellules souches souhaitées pour être utilisé
D-PBS (Ca + +, Mg + + gratuit)	GIBCO	14190-144
Trypsine-EDTA 0,05%	Invitrogen	25300-120
Sérum fœtal bovin (FBS)	Hyclone	SH30071.03
Ferumoxytol (Feraheme)	AMAG	59338-0775-01
Sulfate de protamine	APP Pharm.	22930