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Article de méthode

Détermination de radeaux lipidiques partitionnement de sondes par fluorescence-marqués dans les cellules vivantes par spectroscopie de corrélation de fluorescence (FCS)

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DOI :

10.3791/3513

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6 avril 2012

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1Centre de Recherche de l’Institut du Cerveau et de la Moelle Épinière, Hôpital de la Pitié-Salpêtrière, 2Institut des Sciences Moléculaires d'Orsay, Université Paris-Sud, 3Centre de Photonique Biomédicale du Centre Laser, Université Paris-Sud

Dans cet article

Résumé

Une technique pour sonder le cloisonnement radeau lipidique des protéines fluorescentes à la membrane plasmique de cellules vivantes est décrite. Il tire profit de la disparité des temps de diffusion des protéines situées à l'intérieur ou à l'extérieur des radeaux lipidiques. L'acquisition peut être effectuée de manière dynamique dans des conditions de contrôle ou après l'addition de drogues.

Résumé

Au cours des quinze dernières années la notion que les membranes cellulaires ne sont pas homogènes, et s'appuyer sur des microdomaines à exercer leurs fonctions est désormais largement admis. Les radeaux lipidiques sont des microdomaines membranaires enrichis en cholestérol et en sphingolipides. Ils jouent un rôle dans les processus physiologiques cellulaires tels que la signalisation, et de 1,2 le trafic, mais sont également pensés pour être des acteurs clés dans plusieurs maladies dont les infections virales ou bactériennes et les maladies neurodégénératives 3.

Pourtant, leur existence est encore un sujet de controverse 4,5. En effet, la taille radeau lipidique a été estimé à environ 20 nm 6, loin sous la limite de résolution du microscope conventionnel (environ 200 nm), les empêchant ainsi de l'imagerie directe. Jusqu'à présent, les principales techniques utilisées pour évaluer la partition de protéines d'intérêt à l'intérieur de radeaux lipidiques étaient membranes résistant aux détergents (DRM) d'isolement et de co-patching avec des anticorps. Bien que largement utilisé becal'utilisation de leur mise en œuvre assez facile, ces techniques étaient enclins à des artefacts et donc critiqué 7,8. Les améliorations techniques sont donc nécessaires pour surmonter ces objets et d'être en mesure de sonder lipidique des radeaux de partition dans les cellules vivantes.

Nous présentons ici une méthode pour l'analyse sensible de lipides radeaux partition de protéines par fluorescence-étiquetés ou des lipides dans la membrane plasmique des cellules vivantes. Cette méthode, appelée spectroscopie par corrélation de fluorescence (FCS), repose sur la disparité des temps de diffusion de sondes fluorescentes situées à l'intérieur ou à l'extérieur des radeaux lipidiques. En fait, comme en témoignent les deux membranes artificielles et des cultures cellulaires, les sondes serait de diffuser beaucoup plus rapidement en dehors qu'à l'intérieur des radeaux lipidiques denses 9,10. Pour déterminer des temps de diffusion, minute fluctuations de fluorescence sont mesurées en fonction du temps dans un volume focal (environ 1 femtolitre), situé à la membrane plasmique de cellules avec un microscope confocal (fig.1). Les courbes d'auto-corrélation peut alors être tirée de ces fluctuations et équipé des modèles appropriés de diffusion mathématiques 11.

FCS peut être utilisé pour déterminer le radeau lipidique de cloisonnement de sondes différentes, tant qu'ils sont marquées par fluorescence. Fluorescente marquage peut être obtenue par expression de protéines de fusion fluorescentes ou par liaison de ligands fluorescents. Par ailleurs, FCS peut être utilisé non seulement dans des membranes artificielles et des lignées cellulaires, mais aussi dans des cultures primaires, tel que décrit récemment 12. Il peut également être utilisé pour suivre la dynamique de la séparation des lipides radeau après l'addition de drogues ou de changements dans la composition des lipides membranaires 12.

Protocole

1. Calibrage de l'installation de FCS

  1. Démarrez le microscope confocal, les lasers, les ordinateurs, un incubateur pour la température et le CO 2 de contrôle.
  2. Assurez-vous que le SPAD (Single Photon Avalanche Diode) est allumé et le filtre de fluorescence à l'intérieur du SPAD est bien adapté à votre échantillon. Vérifiez que le SPAD est synchronisé dans le temps. Attention à ne lancer votre logiciel FCS fois vos paramètres SPAD sont prêts pour l'acquisition.
  3. Préparer une solution fraîche de la toxine cholérique Alexa488 dilué dans du PBS pour atteindre une concentration de 1 pg / ml (17,5 nM).
  4. Optimiser imagerie confocale de la solution en utilisant la détection interne du microscope.
  5. Se mettre en mode de balayage et de choisir un point dans l'échantillon de solution. Assurez-vous que la durée de l'éclairage laser est suffisamment long pour effectuer vos acquisitions FCS (> 5 minutes).
  6. Mettre à la détection externe par le SPAD et le logiciel FCS. Surveillez votre signal de fluorescence et assurez-vous qu'il est bien suiTed à la SPAD (signal suffisant, mais pas de saturation, de 10 000 à 50 000 points / s est très bien). Si nécessaire, modifier la position z, le gain et / ou la puissance du laser pour atteindre correcte signal de fluorescence.
  7. L'acquisition de 10 séries de mesures secondes 30. Le temps d'acquisition doit être optimisé pour votre échantillon (compromis entre le meilleur échantillonnage et les problèmes de photoblanchiment).
  8. Analysez vos données (voir l'étape 4) à veiller à ce que vous avez une courbe d'auto-corrélation correspondant à une espèce fluorescentes diffusion en solution (équation dans la Fig. 2) et que le temps de diffusion obtenu après le montage est correct (environ 0,2 ms) (Fig. . 3).

2. La coloration des cellules vivantes avec des lipides radeaux Marker

  1. Plate cellules HEK293 sur 8-même Labteks recouvertes de poly-L-lysine (1mg/ml) la veille de l'imagerie afin de s'assurer que leur adhérence est correcte. Utiliser le milieu sans rouge de phénol pour s'assurer qu'il n'y a pas de perturbation du signal de fluorescence.
  2. Laver les cellules deux fois avec HBSS (solution de Hank saline tamponnée).
  3. Ajouter la toxine cholérique Alexa488 (1 pg / ml) / BSA (0,1%) dans 500 ul HBSS aux cellules pendant 30 minutes à 37 ° C. Toxine cholérique se liera à ganglioside GM1, connu pour être partitionnée préférentiellement dans des radeaux lipidiques.
  4. Laver les cellules deux fois avec HBSS (solution de Hank saline tamponnée).

3. FCS Acquisition de données sur des cellules vivantes

  1. Placez les cellules colorées sur la platine du microscope. Assurez-vous que la température et de CO 2 conditions sont optimales autrement cela peut conduire à des artefacts dans les temps de diffusion.
  2. Optimiser imagerie confocale d'une cellule d'intérêt en utilisant la détection interne du microscope (fig. 4).
  3. Se mettre en mode de numérisation et de choisir un point dans la membrane plasmique de la cellule d'intérêt. Effectuer 1-2 images en direct de la cellule afin de s'assurer de la cellule ne se déplace pas lors de l'acquisition.
  4. Mettre à la détection externe de la SPAD et à la douce FCSware. Surveillez votre signal de fluorescence et assurez-vous qu'il est bien adapté à la SPAD (signal suffisant, mais pas de saturation, 10 000 à 50 000 points / s est très bien). Si nécessaire, modifier la position z, le gain et / ou la puissance du laser pour atteindre correcte signal de fluorescence. Si cela ne suffit pas, vous pouvez envisager de modifier les conditions de coloration.
  5. L'acquisition de 10 échantillons de mesures secondes 30. Comme la plupart des cellules sont auto-fluorescente, vous pouvez voir une diminution de la fluorescence au cours des premières acquisitions, en raison de l'auto-fluorescence décoloration.

4. FCS Analyse des données

  1. Définissez l'intervalle de corrélation et de générer des courbes d'auto-corrélation avec le logiciel FCS. L'intervalle de corrélation varient généralement entre le temps de latence plus court résoluble à le plus longtemps possible (comme les statistiques de la mesure devient de plus en plus insuffisante lorsque le temps de corrélation maximale s'approche le temps total d'acquisition, le temps de latence maximale est limitée à 80% de la temps d'acquisition sur la Picoquant le logiciel).
  2. Pour chaque échantillon, exporter des fichiers correspondant à des fluctuations de fluorescence et d'auto-corrélation en tant que fonction du temps.
  3. Utiliser une analyse des données et des logiciels de montage telles que l'origine Pro pour importer les fichiers.
  4. Pour chaque échantillon, assurez-vous qu'il n'ya pas de photoblanchiment lors de l'acquisition soit la fluorescence reste stable pendant les 30 secondes. Jeter toute mesure affichage photoblanchiment car cela pourrait provoquer artificiels temps de diffusion plus longs.
  5. Vérifiez que la forme de la courbe restant FCS est correct (voir figure 5). Déterminer la courbe moyenne de FCS.
  6. Monter la courbe avec le modèle mathématique approprié (Fig. 2). Cet ajustement sera de vous donner le temps de diffusion (s) et la proportion de molécules qui diffusent avec ce temps de diffusion (ESE) (s).

5. Les résultats représentatifs

Un exemple d'un étalonnage avec un FCS toxine cholérique Alexa488 solution est montré dans la figure 3 (figure 3A), individuels et moyens des courbes FCS ont été calculés. Mean courbes FCS ont été équipés avec des équations correspondant à différents modèles de diffusion (exemples de la figure 2). Le paramètre classiquement considéré pour déterminer la qualité d'un ajustement est le coefficient de détermination R 2. Le plus proche R 2 est à 1, le meilleur est le modèle. Dans ce cas, le modèle le plus précis pour s'adapter à la courbe moyenne de FCS est la description d'une population de molécules fluorescentes diffusant librement en trois dimensions (l'équation 1 dans la figure 2 et la figure 3B). Le temps de diffusion provenant de l'ajustement est de 0,32 ms. Résidus de courbe-raccord (figure 3C) et R 2 facteur (0,99906) fournir une estimation de la qualité de l'ajustement.

Un exemple d'analyse FCS pour la toxine cholérique Alexa488 teinté HEK293 cellules est illustré à la figure 5. La forme moyenne multiphasique courbe FCS révèle l'existence de populations de molécules fluorescentes avec des temps de diffusion différents. Le meilleur ajustement de cette courbe correspond à un modèle à trois populations de sondes fluorescentes: deux avec une diffusion entravée (diffusion en deux dimensions, comme dans le plan de la membrane) et un diffusant librement en trois dimensions (équation 2 dans la Figure 2 et Figure 5) . Population ce dernier correspond à des molécules fluorescentes se déplacent en dehors du plan de membrane, à savoir, soit liaison ou déliaison à leurs cibles membrane, pour atteindre la membrane à travers la voie de sécrétion ou de recyclage, ou sortant de la membrane par endocytose. Les deux temps de diffusion à la membrane, ce qui correspond à la toxine cholérique lié à GM1, sont de 2 ms (25% de molécules), correspondant à la diffusion à l'extérieur de radeaux lipidiques, et 75 ms (50% de molécules), correspondant à la diffusion dans des radeaux lipidiques . S'il vous plaît noter que toute photoblanchimentING lors de l'acquisition conduira à artificielles temps de diffusion plus longs donc peut-être la création d'un biais vers la localisation de GM1 dans les domaines radeaux lipidiques.

Figure 1
Figure 1. Représentation schématique de la FCS set-up (photo modifiée de MARQUER et al. 12)

Figure 2
Figure 2. Exemple de modèles de diffusion et équations correspondantes utilisées pour ajuster les courbes d'autocorrélation. Le paramètre de structure S peuvent être écrites en tant que S = z 0 / n 0 avec z 0 le rayon focale effective le long de l'axe optique de 1 / e 2 intensité et l'efficacité w0 laTeral rayon focal à 1 / e 2 intensité. Ces valeurs peuvent être extraites à partir d'un écart de points fonction classique (PSF) de mesure.

Figure 3
Figure 3. Evaluation du temps de diffusion de la toxine cholérique Alexa488 en solution pour l'étalonnage de FCS. A) de fluctuation de fluorescence en fonction du temps pour un exemple représentatif d'une acquisition 30 secondes. B) Moyenne courbe d'autocorrélation obtenue à partir de 10 échantillons de 30 secondes d'acquisition équipé avec l'équation 1 (voir Figure 2). C) Résidus de l'ajustement de courbes.

Figure 4
Figure 4. HEK-293 cellules colorées avec la toxine cholérique Alexa488. Les cellules ont été imagées sur un microscope confocal SP5 (Leica Microsystems, Wetzlar, Allemagne) sur la ligne laser 488nm interne. Fluorescence ont été recueillies avec un objectif x60 apochromatique immersion plan de l'huile entre 500et 650 nm.

Figure 5
Figure 5. Evaluation du temps de diffusion de la toxine cholérique Alexa488 à la membrane plasmique des cellules HEK293. A) courbe moyenne autocorrélation équipé avec l'équation 2 (voir Figure 2). B) Les résidus de l'ajustement de courbes. (Modifié d'après MARQUER et al. 12)

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Discussion

La méthode présentée ici permet de FCS une analyse sensible et rapide de la répartition des lipides radeau de sondes fluorescentes d'intérêt dans les cellules vivantes. FCS combine la précision de la localisation de la microscopie confocale avec la sensibilité de comptage de photon unique. La principale différence entre FCS et standards techniques biochimiques, c'est que FCS permet la détermination absolue de lipides radeaux de la partition de la cible et non pas la partition relative comme c'est le cas pour...

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Déclarations de divulgation

Pas de conflits d'intérêt déclarés.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par une subvention de l'Agence Nationale de la Recherche (ChoAD). Nous sommes également reconnaissants à la Fondation de l'ICM (Institut du Cerveau et de la Moelle) pour leur soutien financier.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Nom du réactif Entreprise Numéro de catalogue Commentaires
Sous-unité toxine B du choléra-Alexa 488 Invitrogen C-34775 MW (pentamère) = 57 kg / mol
Microscope confocal Leica SP5
Incubateur pour la température et le CO 2 de contrôle La vie des services d'imagerie Le Cube et la boîte de
SPAD (Single Photon Avalanche Diode) MPD (Micro Devices Photon) PDM série (100 um zone sensible)
Passe-haut 488 nm filtre Semrock 488 nm de blocage de bord Brightline filtre passe-long
N ° de pièceails.aspx? id = FF01-488/LP-25 "target =" _blank "> FF01-488/LP-25
Unité de détection de FCS Picoquant Picoharp 300 modules
Acquisition et d'auto-corrélation de logiciels Picoquant SymPhoTime
Logiciel de montage OriginLab OriginPro8

Références

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