Spectral imagerie confocale de fluorescence tels taggés récepteurs nicotiniques dans souris knock-in avec l'administration chronique de nicotine

Résumé

Nous avons développé une nouvelle technique de quantification des changements récepteurs de l'acétylcholine nicotiniques au sein des régions subcellulaires de sous-types spécifiques de neurones du SNC afin de mieux comprendre les mécanismes de dépendance à la nicotine en utilisant une combinaison d'approches, y compris le marquage fluorescent protein du récepteur à l'aide du knock-in approche et spectrale imagerie confocale.

Résumé

Canaux ioniques ligand-dépendants dans le système nerveux central (SNC) sont impliqués dans de nombreuses conditions qui ont de graves conséquences médicales et sociales. Par exemple, la dépendance à la nicotine par le biais du tabagisme est une cause majeure de décès prématuré (Organisation mondiale de la Santé) dans le monde entier et est probablement causée par une altération de l'ion canal de distribution dans le cerveau ^1. L'exposition chronique à la nicotine chez les rongeurs et les humains dans les résultats une augmentation du nombre de récepteurs nicotiniques de l'acétylcholine (nAChR) dans le tissu cérébral ^1-3. De même, des altérations dans les GluN1 ou GluA1 glutamatergiques canaux ont été impliqués dans le déclenchement de la sensibilisation à d'autres drogues addictives comme la cocaïne, les amphétamines et les opiacés ^4-6.

Par conséquent, la capacité de cartographier et de quantifier les schémas de distribution et d'expression des canaux ioniques spécifiques revêt une importance cruciale pour comprendre les mécanismes de dépendance. L'étude du cerveau spécifique à la région effets de médicaments individuels a été avancé par l'avènement des techniques tels que des ligands radioactifs. Cependant, la faible résolution spatiale de la liaison ligand radioactif empêche la capacité à quantifier les canaux ioniques ligand-dépendants dans les sous-types spécifiques de neurones.

Génétiquement codés journalistes fluorescents, tels que la protéine fluorescente verte (GFP) et ses nombreuses variantes de couleurs, ont révolutionné le domaine de la biologie ^7. Par marquage génétiquement un journaliste fluorescent pour une protéine endogène, on peut visualiser les protéines in vivo ^7-10. Un avantage de marquage des protéines par fluorescence avec une sonde est l'élimination de l'utilisation d'anticorps, qui ont des problèmes de non-spécificité et de l'accessibilité à la protéine cible. Nous avons utilisé cette stratégie pour nAChR étiquette fluorescente, qui ont permis l'étude de l'assemblage des récepteurs à l'aide de transfert Förster Resonance Energy (FRET) dans des cellules transfectées en culture ^11. Plus récemment, nous avons utilisé le knock-dans l'approche de souris ingénieur avec une protéine fluorescente jaune marqué a4 nAChR sous-unités (α4YFP), permettant la quantification précise de l'ex vivo des récepteurs à la résolution submicronique dans les neurones du système nerveux central via la microscopie confocale spectrale ^12. Le ciblée fluorescente knock-in mutation est incorporée dans le locus endogène et sous le contrôle de son promoteur natif, produisant des niveaux normaux d'expression et la régulation du récepteur par rapport aux récepteurs non marqués dans les souris de type sauvage. Cette approche knock-in peut être étendue à fluorescence marquer d'autres canaux ioniques et offre une approche puissante de visualiser et de quantifier les récepteurs dans le SNC.

Dans cet article, nous décrivons une méthodologie pour quantifier les changements dans l'expression nAChR dans les neurones du système nerveux central spécifiques après l'exposition à la nicotine chronique. Nos méthodes comprennent l'implantation de la pompe mini-osmotique, fixation par perfusion intracardiaque, l'imagerie et l'analyse des rec nicotinique marquées par fluorescencesous-unités de eptor α4YFP souris knock-in (Fig. 1). Nous avons optimisé la technique de fixation afin de minimiser l'autofluorescence de tissue.We cerveau fixé décrire en détail notre méthodologie d'imagerie utilisant un microscope confocal spectral en conjonction avec un algorithme de déconvolution spectrale linéaire pour soustraire du signal autofluoresent afin d'obtenir avec précision α4YFP signal de fluorescence. Enfin, nous montrons des résultats de chronique induite par la nicotine régulation positive des récepteurs α4YFP dans la voie perforante médiane de l'hippocampe.

Protocole

1. L'implantation de la pompe

1. Avant l'implantation de la pompe, remplir et de préparer les mini-osmotiques ALZET pompes (Alzet, modèle 2002, Cupertino, Etats-Unis) en faisant attention de ne pas introduire de bulles d'air. Ce modèle de mini-osmotique pompe délivre une solution à un taux de 0,5 pi / h pendant 14 jours. Assurer des conditions stériles. Peser pompes vides et remplis. A l'issue de l'expérience (10 jours après l'implantation), le liquide restant dans la pompe peut être enlevée avec une seringue et une aiguille et pesé pour calculer le volume pompé.
2. Pompes avec la solution de contrôle contient une solution saline (0,9% p / v, Teknova, ....

Discussion

L'utilisation d'un récepteur fluorescent dans un modèle de souris knock-in pour déterminer la quantité et la localisation d'un canal ionique spécifique fournit un certain nombre d'avantages. Contrairement aux protéines telles que l'actine, qui est exprimée de manière ubiquitaire dans toutes les cellules, les canaux ioniques sont présents en nombre beaucoup moins et leur expression varie entre les sous-types neuronaux faisant une analyse précise par l'intermédiaire des techniques traditionnelle.......

Matériaux

Nom du réactif	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
mini-osmotiques pompes	Alzet	modèle 2002
saline	Teknova	S5819
(-)-Tartrate de nicotine d'hydrogène	Sigma	N5260
gouttes pour les yeux	Novartis	Tear-Gel
Vetbond colle	3M	1469SB
sel de sodium d'héparine	Sigma	H4784
10x PBS	Invitrogen	70011
kétamine	Wyeth de la santé animale	0856-4403-01
chlorhydrate medatomidine	Pfizer	1950673
23G papillon aiguille	Becton Dickinson	367253
paraformaldéhyde	Sciences Electron Microscopy	15710
moule en plastique plongement	VWR	18986-1
Montage composé OCT	Tissue-Tek	4583
Mowiol 4-88	EMD-Calbiochem	475904	pH 8,5