Spectral imagerie confocale de fluorescence tels taggés récepteurs nicotiniques dans souris knock-in avec l'administration chronique de nicotine

Résumé

Nous avons développé une nouvelle technique de quantification des changements récepteurs de l'acétylcholine nicotiniques au sein des régions subcellulaires de sous-types spécifiques de neurones du SNC afin de mieux comprendre les mécanismes de dépendance à la nicotine en utilisant une combinaison d'approches, y compris le marquage fluorescent protein du récepteur à l'aide du knock-in approche et spectrale imagerie confocale.

Résumé

Canaux ioniques ligand-dépendants dans le système nerveux central (SNC) sont impliqués dans de nombreuses conditions qui ont de graves conséquences médicales et sociales. Par exemple, la dépendance à la nicotine par le biais du tabagisme est une cause majeure de décès prématuré (Organisation mondiale de la Santé) dans le monde entier et est probablement causée par une altération de l'ion canal de distribution dans le cerveau ^1. L'exposition chronique à la nicotine chez les rongeurs et les humains dans les résultats une augmentation du nombre de récepteurs nicotiniques de l'acétylcholine (nAChR) dans le tissu cérébral ^1-3. De même, des altérations dans les GluN1 ou GluA1 glutamatergiques canaux ont été impliqués dans le déclenchement de la sensibilisation à d'autres drogues addictives comme la cocaïne, les amphétamines et les opiacés ^4-6.

Par conséquent, la capacité de cartographier et de quantifier les schémas de distribution et d'expression des canaux ioniques spécifiques revêt une importance cruciale pour comprendre les mécanismes de dépendance. L'étude du cerveau spécifique à la région effets de médicaments individuels a été avancé par l'avènement des techniques tels que des ligands radioactifs. Cependant, la faible résolution spatiale de la liaison ligand radioactif empêche la capacité à quantifier les canaux ioniques ligand-dépendants dans les sous-types spécifiques de neurones.

Génétiquement codés journalistes fluorescents, tels que la protéine fluorescente verte (GFP) et ses nombreuses variantes de couleurs, ont révolutionné le domaine de la biologie ^7. Par marquage génétiquement un journaliste fluorescent pour une protéine endogène, on peut visualiser les protéines in vivo ^7-10. Un avantage de marquage des protéines par fluorescence avec une sonde est l'élimination de l'utilisation d'anticorps, qui ont des problèmes de non-spécificité et de l'accessibilité à la protéine cible. Nous avons utilisé cette stratégie pour nAChR étiquette fluorescente, qui ont permis l'étude de l'assemblage des récepteurs à l'aide de transfert Förster Resonance Energy (FRET) dans des cellules transfectées en culture ^11. Plus récemment, nous avons utilisé le knock-dans l'approche de souris ingénieur avec une protéine fluorescente jaune marqué a4 nAChR sous-unités (α4YFP), permettant la quantification précise de l'ex vivo des récepteurs à la résolution submicronique dans les neurones du système nerveux central via la microscopie confocale spectrale ^12. Le ciblée fluorescente knock-in mutation est incorporée dans le locus endogène et sous le contrôle de son promoteur natif, produisant des niveaux normaux d'expression et la régulation du récepteur par rapport aux récepteurs non marqués dans les souris de type sauvage. Cette approche knock-in peut être étendue à fluorescence marquer d'autres canaux ioniques et offre une approche puissante de visualiser et de quantifier les récepteurs dans le SNC.

Dans cet article, nous décrivons une méthodologie pour quantifier les changements dans l'expression nAChR dans les neurones du système nerveux central spécifiques après l'exposition à la nicotine chronique. Nos méthodes comprennent l'implantation de la pompe mini-osmotique, fixation par perfusion intracardiaque, l'imagerie et l'analyse des rec nicotinique marquées par fluorescencesous-unités de eptor α4YFP souris knock-in (Fig. 1). Nous avons optimisé la technique de fixation afin de minimiser l'autofluorescence de tissue.We cerveau fixé décrire en détail notre méthodologie d'imagerie utilisant un microscope confocal spectral en conjonction avec un algorithme de déconvolution spectrale linéaire pour soustraire du signal autofluoresent afin d'obtenir avec précision α4YFP signal de fluorescence. Enfin, nous montrons des résultats de chronique induite par la nicotine régulation positive des récepteurs α4YFP dans la voie perforante médiane de l'hippocampe.

Protocole

1. L'implantation de la pompe

1. Avant l'implantation de la pompe, remplir et de préparer les mini-osmotiques ALZET pompes (Alzet, modèle 2002, Cupertino, Etats-Unis) en faisant attention de ne pas introduire de bulles d'air. Ce modèle de mini-osmotique pompe délivre une solution à un taux de 0,5 pi / h pendant 14 jours. Assurer des conditions stériles. Peser pompes vides et remplis. A l'issue de l'expérience (10 jours après l'implantation), le liquide restant dans la pompe peut être enlevée avec une seringue et une aiguille et pesé pour calculer le volume pompé.
2. Pompes avec la solution de contrôle contient une solution saline (0,9% p / v, Teknova, S5819, Hollister, Etats-Unis). Pour préparer la solution de la nicotine, une solution à 1 M de stocks (-)-nicotine tartrate d'hydrogène (Sigma, cat # N5260) est dilué dans une solution saline (0,9% p / v) et stérilisé par filtration à travers un de 0,22 um seringue extrémité du filtre. Nous avons déjà administré la nicotine à 0,4 et 2 mg / kg / h (calculés en base libre de nicotine) pendant 10 jours.
3. Préparer trois bains salins (trois10 cm rempli une solution saline des boîtes de Pétri). Une fois que la pompe a été rempli et plafonné, pompe de lavage à fond dans chaque salle de bain successives du sérum physiologique pour éliminer toute trace de la drogue sur la coque extérieure. Plonger remplie pompes dans une solution saline pour le stockage jusqu'à ce que la chirurgie, en gardant le contrôle et les pompes à nicotine dans des contenants salins.
4. Afin d'encourager une reprise saine et réduire le risque de l'infection post-chirurgicale, ont des cages propres préparés à long terme de récupération.
5. Pour redressement à court terme immédiatement après la chirurgie, de préparer une cage contenant un coussin chauffant et une lampe chauffante.
6. Pour examiner chroniques effets de la nicotine, nous avons 5 à 6 α4YFP homozygote souris knock-in (2-3 mois) dans chaque groupe (de contrôle ou de la nicotine). Le knock-in α4YFP lignée de souris ont été rétrocroisées depuis 10 générations à la souche de souris C57BL/6J. Nous veillons à l'âge et le sexe de toutes les souris sont les mêmes pour l'étude et que toutes les chirurgies sont effectuées le même jour pour minimiser la variabilité. Pour éviter hyhypothermie chez les souris pendant et après la chirurgie, d'équiper la table chirurgicale avec un coussin chauffant recouvert de drap chirurgical stérile.
7. Provoquer l'α4YFP knock-in à la souris avec 3 L / min d'oxygène et 3% d'isoflurane et maintenir une anesthésie à 2,5 L / min d'oxygène et 1% d'isoflurane. Nous préférons anesthésie à l'isoflurane, car à la fin de la chirurgie isoflurane efface le système rapidement et les souris sont conscients et mobiles au sein de ~ 2 min. Appliquer des gouttes oculaires immédiatement (Tear-Gel, Novartis) pour éviter d'endommager la cornée.
8. Les pompes sont implantés sous la peau par une incision cutanée sur le dos de la nuque et la pompe est poussé vers le bas caudale de la face dorsale de l'arrière. Essuyez la zone à l'arrière entre les pattes avant avec de l'éthanol 95% à mat de la fourrure. Pincer la peau avec une pince Graefe 0,8 mm (Outils belle science, 11050-10) et faire une coupe de 1 cm latéral central en utilisant des ciseaux à iris (Outils belle science, 14060-10).
9. Pour créer un espace sous-cutané de la pompe, insérer ciseaux modèle standards (Science Tools Fine, 14101-14) dans l'incision et les pousser vers attentivement l'extrémité caudale de l'animal.
10. Utilisation de 1,0 mm pince Graefe (Outils belle science, 11650-10), retirer la pompe du sérum physiologique. Maintenez les incision ouverte pince à l'aide et insérer la pompe dans l'incision avec le bouchon de la pompe osmotique face à l'extrémité caudale de l'animal et pousser la pompe à l'extrémité caudale.
11. Pincée enroulé fermer en utilisant une pince 0,8 mm et d'appliquer une quantité suffisante de Vetbond (3M, cat # 1469SB) colle. Attendez jusqu'à ce que la plaie est scellé.
12. Retirer l'animal de masque isoflurane, injecter l'analgésique, le meloxicam (0,1 mg / kg sc), et le placer dans une cage de récupération à court terme jusqu'à conscient et mobile. Puis placez-le dans une cage de récupération à long terme avec libitum nourriture et d'eau disponibles ad.

2. α4YFP knock-in de fixation de la souris par perfusion intracardiaque

1. Faire des solutions un jour avant la procédure et de laisser à 4 ° C. Pour minimiser la variabilité toutes les sourissera perfusé le même jour et avec le même lot de solutions.
2. Effectuer fixations de perfusion dans un endroit bien ventilé. Rincer la ligne de la pompe péristaltique (Masterflex Easy Load, 7518-00; pompe Masterflex contrôleur, 60648) avec ddH ₂ O.
3. Ajouter ~ 0.0015g de l'héparine (Sigma, cat # H4784), un anticoagulant, à 20 ml de PBS pH 7,6 (Invitrogen, cat # 70011).
4. Anesthésier α4YFP la souris knock-in en injectant par voie intramusculaire d'un mélange de kétamine (25 mg / kg, Wyeth Animal Health) et le chlorhydrate de medatomidine (0,25 mg / kg, Pfizer) dans le muscle de la jambe arrière et placez immédiatement l'animal dans sa cage de retour à domicile.
5. Pin animal à un couvercle en polystyrène inséré dans un plateau en métal. Essuyez le thorax avec de l'éthanol à 95%. La peau pincée avec Adson Pince (Outils belle science, 91106-12) et snip ouvrir la cavité thoracique avec des ciseaux à iris. Fixer la cage thoracique en utilisant une pince hémostatique ultra fine (Outils belle science, 13021-12) et d'exposer le coeur.
6. Commencez à pomper du PBS à 4 ml / min et insert une aiguille 23G papillon (Becton Dickinson, 367 253) dans le ventricule gauche de l'animal. Immédiatement snip l'oreillette droite pour permettre au sang et perfusat de s'échapper.
7. Perfuser 20 ml de PBS (pH 7,6), puis 30 ml de paraformaldéhyde à 4% (pH 7,6, dilué avec du PBS à partir d'un stock de 16% PFA, Sciences Electron Microscopy, cat # 15710), puis 20 ml de 5% de saccharose (pH 7,6) . Nous avons constaté que la fixation sur les augmentations autofluorescence. Perfusion avec 5% de saccharose rince résiduelle PFA à partir du cerveau, ce qui diminue d'autofluorescence.
8. Retirez le cerveau et le ranger dans de saccharose à 30% pendant 3 jours.
9. Pour congeler le cerveau pour la coupe coronale, couper le cervelet avec une lame de rasoir et le cerveau dans un moule en plastique enrobage (VWR, cat # 18986-1) côté rostral et se plonger dans de montage composé OCT (Tissue-Tek, cat # 4583) . Congeler dans la glace sèche et conserver à -20 ° C avant de trancher.
10. Cerveaux section (30 um d'épaisseur) sur un cryostat et puis transfert à lames enduites. Conserver les coupes de cerveau à -20 ° C dans des boîtes de diapositives contenant une pierre de sulfate de calcium anhydre. La boîte de diapositive devrait être dans un sac à fermeture zip étanche pour éviter l'humidité et le congélateur après brûler lorsqu'ils sont conservés à -20 ° C.

3. D'imagerie spectrale nAChR fluorescent à l'aide de microscopie confocale

1. Assurez-lames ont une exposition minimale à toute source de lumière pour réduire au minimum photoblanchiment.
2. Lamelle les rails en section de cerveau avec un support de montage qui n'inhibe pas la fluorescence protéine fluorescente. Nous avons un bon succès avec Mowiol 4-88 (pH 8,5 dans un tampon Tris-HCl et de glycérol, EMD-Calbiochem, cat # 475904), qui durcit après quelques heures. Assurez-vous que l'Mowiol s'équilibre à la température ambiante avant de glisser la couverture afin d'éviter les bulles d'air. Ne pas utiliser de vernis à ongles lorsque le couvercle glissant car il étancher la fluorescence YFP.
3. Les images sont acquises en utilisant un système de Nikon C1si spectrale microscope confocal. Détails sur la méthode de l'imagerie confocale spectrale et démixage linéaire sont de fournird ailleurs ^13-15. La justification de l'utilisation d'un microscope confocal spectral, c'est que le tissu cérébral fixe a autofluorescence intrinsèque. Spectral imagerie confocale sur la C1si Nikon utilise un tableau de 32 détecteurs photomultiplicateurs cet échantillon une gamme spécifique de longueurs d'onde de la lumière fluorescente émise, réfractée dans l'espace dans ses différentes longueurs d'onde par l'intermédiaire d'un élément dispersif réseau comme un prisme réfractant la lumière blanche en un arc en ciel de couleurs ^16. Ce qui est recueillie est une pile d'images lambda - images recueillies à différentes longueurs d'onde de la lumière de telle sorte que le spectre d'émission sont recueillies pour chaque pixel d'une pile d'images lambda. Depuis la YFP et autofluorescence des tissus ont chacun caractéristiques signatures spectrales, la pile lambda peut être déconvolué utilisant un algorithme de déconvolution algébrique linéaire en YFP séparée et des signaux autofluorescentes (fig. 2). Ainsi, la quantification très précise de la YFP fluorescence peut être déterminée, même dans les tissus avec des niveaux significatifs de l'UAtofluorescence.
4. Divers paramètres peuvent être ajustés pour optimiser la qualité d'image et l'efficacité de collecte de fluorescence. Nous rendrons compte de paramètres que nous utilisons habituellement, mais ces paramètres peuvent être ajustés en fonction de l'échantillon et le microscope confocal. Pour quantifier avec précision les changements dans l'expression sous-unité α4YFP avec de la nicotine chronique nous nous assurons que l'intensité d'échelle de gris au niveau des signaux de tous les pixels sont inférieurs à la valeur de saturation (<4095 pour 12 bits en échelle de gris). Par ailleurs, nous accueillons pour l'augmentation potentielle de signal due à une régulation positive des récepteurs en ajustant les paramètres confocaux de sorte que les pixels sont près d'un tiers de la valeur de saturation (~ 1300-1400) ou moins. Une fois les paramètres sont optimisés, les paramètres sont maintenus identiques pour toutes les sessions d'imagerie et des échantillons.
5. Nous utilisons les paramètres suivants pour l'imagerie α4YFP l'aide d'une huile de 60X FCI plan Apo VC objectif (1,40 NA, 0,13 mm de distance de travail): 488 nm à ligne laser de transmission maximale de 15% d'un laser Argon 40 mW, Le gain de détection spectrale à 220, plage spectrale imagée de 496,5 nm à 656,5 nm à 5 nm de résolution, 512 x 512 pixels sur une um 50 x 50 microns, une zone de taille moyenne sténopé (60 diamètre um), un pixel 4,08 temps de séjour, en moyenne plus de deux balayages et 12 bits de niveaux de gris.

4. Démixage linéaire de spectrales images confocales et l'analyse d'image

1. Pour effectuer linéaire de déconvolution spectrale sur un échantillon d'image prise avec un microscope confocal spectral, il faut d'abord acquérir un spectre de référence pour la YFP et un spectre de référence pour l'autofluorescence des tissus.
2. Un préalable important pour tout le spectre de référence est d'obtenir un signal élevé spectre de fluorescence du bruit imagé avec la ligne même laser utilisé pour l'imagerie de vos échantillons. Bien que la ligne laser à 514 nm de l'argon a une plus grande efficacité d'excitation pour exciter YFP nous préférons à la YFP image avec la ligne de 488 nm laser, car il ya une meilleure séparation de la pic d'émission de la YFP et la ligne de 488 nm est moins likely de fausser le pic et l'on peut obtenir le spectre d'émission YFP ensemble, y compris la montée en pointe. Nous YFP l'image soluble transfecté dans une lignée cellulaire de sorte qu'un signal YFP forte est obtenue et le spectre YFP résultante est stockée dans notre bibliothèque de spectres de référence. Α4YFP transfectées surexprimé dans des lignées cellulaires peuvent également être utilisés, car il fournira également un signal de haute au spectre de fond.
3. Pour obtenir un spectre de référence de l'autofluorescence autofluorescence image que nous partir d'une section de type sauvage à partir de cerveau de souris les différentes régions du cerveau que nous avons l'intention à l'image de la souris α4YFP et d'obtenir leur spectre correspondant. Nous utilisons la ligne même laser, 488 nm, et l'image en utilisant les paramètres à peu près identiques, bien que nous puissions modifier le gain du détecteur, l'intensité du laser ou de réaliser une imagerie en moyenne pour maximiser signal sur bruit.
4. Après obtention d'une image spectrale confocale à partir d'une région du cerveau de la souris α4YFP, l'image est alors déconvolué dans son YFP et autofluorescence signaux en appliquant un algorithme de déconvolution linéaire spectrale en utilisant le spectre de référence de la YFP et le spectre de référence d'auto-fluorescence de la souris de type sauvage de la région du cerveau même.
5. L'image α4YFP sans mélange peut ensuite être ouverte dans un logiciel d'analyse d'image tel que ImageJ ( http://rsbweb.nih.gov/ij/ ) puis l'intensité de pixel moyenne est calculée pour la région d'intérêt. Un plugin pour ImageJ appelé "loci_tools.jar" ( http://www.loci.wisc.edu/bio-formats/imagej ) peut être utilisé pour importer Nikon ics / ids fichiers confocale.
6. Nous répétons la même démixage spectral linéaire et l'analyse de type sauvage souris dans la même région cérébrale pour obtenir une valeur de fond résiduel.
7. Puis on obtient l'intensité moyenne corrigée α4YFP en soustrayant la valeur de fond résiduel (4,6) de la valeur moyenne non corrigée α4YFP (4,5).

5. Les résultats représentatifs

On montre une projection en couleur représentant vraie d'un empilement lambda d'images de la habenula médiale partir d'une souris homozygote α4YFP (fig. 3A) prise au microscope spectrale confocale. Nous montrons aussi le spectre d'émission d'une région d'intérêt contenant α4YFP neurones positifs à partir de l'image lambda même pile (Fig. 3B). Un pic d'émission distincte ressort à ~ 527 nm, qui est le pic d'émission de fluorescence de la YFP. La région voisine de la montre interne habenula un spectre d'émission défaut à un pic spectral 527 nm, indiquant l'absence de sous-unités nAChR α4YFP. À la suite de déconvolution spectrale linéaire en utilisant des spectres de référence de la YFP et autofluoresence cerveau de la souris avec un chevauchement important des émissions (fig. 4), la séparation de la YFP et de signaux autofluorescente est possible rendement d'une image α4YFP sans mélange, une image autofluorescente sans mélange et un canal restant. La localisation précise de la grippe α4YFPorescence peuvent être identifiés dans le soma serrés de la médiane habenula (Fig. 4).

Dans le α4YFP hippocampe est localisée principalement dans la voie perforante médiane, le chemin temporo-ammonic et le alveus ^12. Ce sont tous les innervation glutamatergique de l'hippocampe. Nous avons examiné les effets de la nicotine chronique sur l'expression α4YFP dans la voie perforante hippocampique (Fig. 5). L'administration chronique de nicotine (2 mg / kg / h pendant 10 jours) a entraîné une augmentation significative (69 ± 14%) dans α4YFP fluorescence de souris témoins traitées salines de chroniques de nicotine chez les souris traitées (p = 0,001, test de Wilcoxon) ( Fig. 5).

Diagramme Figure 1. Montrant la procédure à des changements d'image en sous-unités nAChR α4YFP avec la nicotine chronique. Mini-osmotiques pompes sont remplis de solution saline ou de la nicotine et implantation sous-cutanée in & alpha; 4YFP souris homozygotes. Après 10 jours chez la souris sont perfusées et fixées avec du paraformaldéhyde 4% et les cerveaux de souris sont sectionnés (30 um d'épaisseur) sur des lames. La section du cerveau est représenté sur un microscope confocal spectral (Nikon C1si) et spectralement pur en images YFP et autofluorescente. Ensuite, les images sont analysées α4YFP plus loin avec le logiciel ImageJ.

Figure 2. Un schéma de principe d'une pile lambda imagée à partir d'un microscope confocal spectral et linéairement mêlée dans ses composantes spectrales. (A) une pile d'images lambda est recueillie. (B) Une pile lambda se compose d'images recueillies à différentes longueurs d'onde de la lumière de telle sorte que le spectre d'émission est recueillie pour chaque pixel dans l'ensemble de la pile. (C) Depuis YFP et autofluorescence tissulaire ont chacun signatures spectrales caractéristiques, la pile lambda peut être déconvolué l'aide d'un algorithme de démixage linéaire algébrique en sYFP eparate et des signaux autofluorescentes. Ainsi, la quantification très précise de la YFP fluorescence peut être déterminée, même dans les tissus avec des niveaux élevés de l'autofluorescence.

Figure 3. Image confocale spectrale d'une région du cerveau exprimant nAChR α4YFP. (A) une projection en couleur vraie d'un empilement lambda d'images de la habenula médiale d'une souris α4YFP prise avec un microscope confocal Nikon C1si spectrale. (B) des graphiques de spectres d'une région d'intérêt, qui comprend α4YFP neurones contenant (vert), et une région d'intérêt à l'extérieur de l'habenula médiale (rouge).

Figure 4. Linéaire de déconvolution spectrale de l'habenula médial. (A) Images de α4YFP non mélangés et (B) à la suite d'autofluorescence démixage spectral linéaire. (C) des spectres de référence de la YFP (vert triangles) et autofluorescence (cercles jaunes) utilisé pour déconvolution spectrale.

Figure 5. Régulation à la hausse de la a4 nAChR dans l'hippocampe de α4YFP knock-in chez les souris exposées à la nicotine chronique. (A) Un montage de carrelage α4YFP fluorescence provenant de l'hippocampe. Les deux zones de sélection en pointillés sont les emplacements approximatifs sur le membre inférieur de la voie perforante de l'hippocampe où les analyses ont été effectuées pour chaque souris. (B) α4YFP fluorescence était significativement plus élevée dans la voie perforante de souris exposées à la nicotine chronique que solution saline chronique (*, p = 0,001, test de Wilcoxon). Les résultats représentent la moyenne ± SEM de n = 20 mesures pour les souris à la fois la nicotine salines et chroniques traitées (5 souris de chaque groupe de traitement).

Figure 6. Mieux dl'expression de ROFONDEUR α4YFP par rapport à l'étiquetage des anticorps. Vues orthogonales de XZ α4YFP fluorescence (A) et VGLUT2 anticorps avec Cy5 que une étiquette secondaire (B). (C) Parcelles montrant une plus grande dégradation de l'intensité du signal de fluorescence de la profondeur pour la coloration des anticorps (carrés noirs) par rapport à α4YFP (cercles ouverts).

Discussion

L'utilisation d'un récepteur fluorescent dans un modèle de souris knock-in pour déterminer la quantité et la localisation d'un canal ionique spécifique fournit un certain nombre d'avantages. Contrairement aux protéines telles que l'actine, qui est exprimée de manière ubiquitaire dans toutes les cellules, les canaux ioniques sont présents en nombre beaucoup moins et leur expression varie entre les sous-types neuronaux faisant une analyse précise par l'intermédiaire des techniques traditionnelle...

Matériaux

Nom du réactif	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
mini-osmotiques pompes	Alzet	modèle 2002
saline	Teknova	S5819
(-)-Tartrate de nicotine d'hydrogène	Sigma	N5260
gouttes pour les yeux	Novartis	Tear-Gel
Vetbond colle	3M	1469SB
sel de sodium d'héparine	Sigma	H4784
10x PBS	Invitrogen	70011
kétamine	Wyeth de la santé animale	0856-4403-01
chlorhydrate medatomidine	Pfizer	1950673
23G papillon aiguille	Becton Dickinson	367253
paraformaldéhyde	Sciences Electron Microscopy	15710
moule en plastique plongement	VWR	18986-1
Montage composé OCT	Tissue-Tek	4583
Mowiol 4-88	EMD-Calbiochem	475904	pH 8,5