Research Article
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Le VisioTracker est un système automatisé pour l'analyse quantitative de la performance visuelle des poissons adultes et des larves petit basée sur l'enregistrement des mouvements oculaires. Il dispose d'un contrôle total sur les propriétés de stimulation visuelle et analyse en temps réel, ce qui permet à haut débit recherches dans des domaines tels que le développement du système visuel et de la fonction, de la pharmacologie, des études de circuits neuronaux et de l'intégration sensori-motrice.
Les enquêtes sur le développement du système visuel et la fonction nécessite quantifiables modèles comportementaux de performances visuelles qui sont faciles à obtenir, robuste et simple à manipuler. Un modèle approprié a été trouvé dans la réponse optocinétique (OKR), un comportement réflexif présente chez tous les vertébrés en raison de sa valeur de sélection de haut. L'OKR implique lents stimulus suivantes mouvements des yeux alternaient avec des saccades rapides rappel. La mesure de ce comportement est facilement réalisée chez les larves de poisson zèbre, en raison de sa précocité et stable (entièrement développée après 96 heures après la fécondation (hpf)), et bénéficiant d'une connaissance approfondie sur le poisson zèbre génétique, depuis des décennies l'un des modèle favorisée organismes dans ce domaine. En attendant l'analyse des mécanismes similaires dans les poissons adultes a gagné en importance, en particulier pour des applications pharmacologiques et toxicologiques.
Nous décrivons ici VisioTracker, un système entièrement automatisé, à haut throughpusystème de t pour l'analyse quantitative de la performance visuelle. Le système est basé sur des recherches effectuées dans le groupe du Prof Stephan Neuhauss et a été re-conçu par les systèmes EST. Il se compose d'un dispositif de blocage pour les petits poissons surveillée par une caméra vidéo de haute qualité équipé d'un objectif zoom haute résolution. Le récipient de poisson est entouré d'un tamis à tambour, sur lequel configurations de stimulus générés par ordinateur peut être projetée. Les mouvements oculaires sont enregistrées et analysées automatiquement par le logiciel VisioTracker en temps réel.
L'analyse des données permet la reconnaissance immédiate des paramètres tels que la durée de la phase lente et rapide, la fréquence du cycle de mouvement, lent-phase et de gain, l'acuité visuelle et la sensibilité au contraste.
Des résultats typiques permettent par exemple l'identification rapide des mutants du système visuel qui ne présentent aucune altération apparente dans la morphologie de type sauvage, ou la détermination des effets quantitatifs de la pharmacologiques ou toxiques et mutagènesagents sur les performances du système visuel.
1. L'élevage de poissons
Les embryons ont été conservés et élevés dans des conditions standard (Marque 2002) et mis en scène en fonction du développement de jours après la fécondation (dpf). Les adultes et les larves à 5 dpf été utilisé pour les mesures.
2. Procédure expérimentale
Larves: Les larves de poissons ont été embarqués dans 3% préchauffé (28 ° C) de méthylcellulose pour empêcher les mouvements du corps. Les embryons ont été placés face dorsale dans la VisioTracker, face à l'écran de projection. Les poissons adultes: poissons ont été brièvement anesthésiés dans 300 mg / l de MS-222, inséré dans le dispositif d'immobilisation et placé dans le VisioTracker. Avant de mesures ont été initiées, ils ont été laissés au repos pendant 1-2 min.
Configurations de stimulus consistant verticales en noir et blanc sinusoïdaux grilles tournantes autour du poisson ont été créésen utilisant le logiciel propriétaire. Ils pourraient être modulée par le logiciel en fonction de la forme d'onde, le contraste, l'intensité, la vitesse angulaire et la fréquence spatiale. Modèles ont été projetées sur l'écran à l'aide d'un projecteur numérique de la lumière contenue dans le VisioTracker. La distance approximative entre l'œil du poisson et l'écran est de 4,5 cm, et la taille de projection sur écran 360 degrés à l'horizontale était et 55 ° verticalement. Pour les larves de poissons, la direction de stimulation a été modifiée avec une fréquence de 0,33 Hz pour réduire la fréquence des saccades. Les poissons adultes ont été stimulées unidirectionnelle et que l'oeil stimulé dans temporelle-à-nasale direction a été pris en considération, puisque la vitesse de l'œil nez-à-temporelle est en général nettement plus bas et moins constante (voir Mueller et Neuhauss, 2010).
A l'image de champ clair de la tête du poisson a été introduit dans une caméra vidéo infrarouge. Éclairage infrarouge de poissons a été effectuée from ci-dessous. La caméra enregistre des images à une cadence de 5 images / seconde (larves) ou 12,5 images / seconde (adultes), respectivement. Les images sont automatiquement traitées, corrigées et lissés pour la forme des yeux. L'orientation des yeux par rapport à l'axe horizontal est alors déterminée automatiquement et la vitesse de l'œil a été calculée par le logiciel propriétaire. Petits mouvements du poisson ont été corrigées automatiquement par le logiciel. Tout d'enregistrement et d'analyse a été réalisée en temps réel.
3. Post-traitement des données expérimentales
4. Les résultats représentatifs:
Pour le poisson-zèbre larvaire, le mutant pare-chocs a été choisi. Dans ce mutant, les cellules épithéliales hyperproliferate lentille, ce qui conduit à la taille réduite de lentille et l'emplacement de la lentille ectopique. Ces altérations morphologiques se traduisent par une réduction significative de la sensibilité au contraste et l'acuité visuelle (Schönthaler et al., 2010). La figure 1 montre la différence de sensibilité au contraste des mutants pare-chocs contre de type sauvage frères et sœurs. Mutants pare-chocs de plus en plus ne parviennent pas à régler la vitesse de l'œil avec la diminution de contraste de relance. Par analogie, lorsque la fréquence de stimulation est augmentée spatiale, c'est à dire la largeur de bande de stimulation est réduite, de même pour voiture mutants démontrent baisse de l'acuité visuelle (Fig. 2)
La dépendance de l'adulte poisson zèbre visuaperformances l sur les conditions environnementales a été étudiée en soumettant le poisson à diverses concentrations d'alcool dans leur réservoir d'eau pendant 30 minutes, puis mesurer la réponse optocinétique dans des conditions différentes de relance. Le poisson zèbre adulte montrent une réduction marquée de la sensibilité au contraste lorsqu'elles sont maintenues à des concentrations croissantes d'alcool (Fig. 3). Une même dose-dépendante de réduction de la vitesse de l'œil d'ensemble sur une large plage de fréquences spatiales pu être observé lorsque les poissons ont été traitées avec des concentrations croissantes d'alcool (Fig. 4). Traitement de l'alcoolisme en outre dépendante de la dose réduit les performances oculomotrices à des tâches plus exigeantes comme l'illustre par des vitesses accrues de relance (Fig. 5).
Figure 1. Vitesse Zebrafish yeux des larves dépend Contrairement stimulus. 10 et 10 mutants pare-chocs de type sauvage frères et sœurs ont été analysés à 5 dpf s dans diverses conditions timulus contraste bande. Le graphique montre que la vitesse moyenne des yeux ± 1 écart-type.
Figure 2. Zebrafish oeil larvaire vitesse dépend de la fréquence spatiale. 10 et 10 mutants pare-chocs de type sauvage frères et sœurs ont été soumis à différentes largeurs de bande de relance à 5 dpf et analysé comme décrit. Le graphique montre que la vitesse moyenne des yeux ± 1 écart-type.
Figure 3. Zebrafish spectacle pour adultes dépendant de la concentration d'alcool dans la réduction de la sensibilité au contraste. Adult poisson zèbre ont été maintenus à des concentrations variables d'alcool comme il est indiqué pendant 30 minutes et analysées dans des conditions différentes de relance de contraste bande. Le graphique montre la vitesse moyenne temporelle oeil-à-nasal ± 1 SEM de 9 poissons par groupe (à l'exception du groupe témoin: n = 11).
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Figure 4. Zebrafish spectacle pour adultes dépendant de la concentration d'alcool dans le mouvement des yeux réduction globale sur une large gamme de largeur de bande de relance. Adult poisson zèbre ont été maintenus à des concentrations variables d'alcool comme il est indiqué pendant 30 minutes et analysées dans des conditions différentes de relance largeur de bande. Le graphique montre la vitesse moyenne temporelle oeil-à-nasal ± 1 SEM de 9 poissons par groupe (à l'exception du groupe témoin: n = 11).
Figure 5. Adultes montrent l'alcool Zebrafish dépendante de la concentration réduction des mouvements oculaires globale sur une large plage de vitesses de relance. Adult poisson zèbre ont été maintenus à des concentrations variables d'alcool comme il est indiqué pendant 30 minutes et analysés sous différentes conditions de vitesse de relance. Le graphique montre la vitesse moyenne temporelle oeil-à-nasal ± 1 SEM de 9 poissons par groupe (à l'exception du groupe de contrôle:n = 11).
Oliver DR Schnaedelbach et Holger D. Russig sont des employés de TSE Systems GmbH qui produit le système de suivi des performances visuelles utilisées dans cet article. La production de cet article a été parrainé par le TSE Systems GmbH. Stephan FC Neuhuass est un employé de l'Université de Zurich qui reçoit une rémunération par les systèmes de l'EST pour chaque système vendu.
Le VisioTracker est un système automatisé pour l'analyse quantitative de la performance visuelle des poissons adultes et des larves petit basée sur l'enregistrement des mouvements oculaires. Il dispose d'un contrôle total sur les propriétés de stimulation visuelle et analyse en temps réel, ce qui permet à haut débit recherches dans des domaines tels que le développement du système visuel et de la fonction, de la pharmacologie, des études de circuits neuronaux et de l'intégration sensori-motrice.
KPM a été soutenu par l'UE FP7 (RETICIRC).
| Nom du réactif | Entreprise | Numéro de catalogue |
|---|---|---|
| Méthylcellulose | Sigma-Aldrich | M0387 |
| Ethyl 3-aminobenzoate méthanesulfonate (MS-222) | Sigma-Aldrich | E10521 |
| Boîte de 35 mm de culture cellulaire | Corning | 430165 |
| Sérum pipette | Greiner Bio-One | 612 361 |
| VisioTracker | Systèmes TSE | 302060 |
