Nous démontrons comment disséquer et à la culture chiches E4 et E6 ganglionnaires statoacoustic explants de la moelle épinière. Les explants sont cultivés dans un milieu sans sérum dans des gels de collagène 3D pour 24 heures. Réactivité neurites est testé avec support du facteur de croissance complété et revêtu de protéine avec des perles.
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Article de méthode
Dissection et la culture de cellules de ganglions et de Chick Statoacoustic explants moelle épinière dans des gels de collagène pour des essais de neurites
Dans cet article
Résumé
Résumé
Les organes sensoriels de l'oreille interne de poulet sont innervés par le processus périphériques du ganglion statoacoustic (SAG) des neurones. Innervation organe sensoriel repose sur une combinaison de signaux de guidage axonal 1 et 2 facteurs de survie situé le long de la trajectoire des axones en croissance et / ou au sein de leurs objectifs organe sensoriel. Par exemple, les interférences fonctionnelles avec une voie de guidage des axones classiques de signalisation, sémaphorine-neuropiline, a généré l'erreur d'acheminement des axones otique 3. En outre, plusieurs facteurs de croissance exprimés dans les objectifs sensorielles de l'oreille interne, y compris la neurotrophine-3 (NT-3) et le facteur neurotrophique dérivé du cerveau (BDNF), ont été manipulées dans des animaux transgéniques, conduisant de nouveau à l'erreur d'acheminement de 4 axones SAG. Ces mêmes molécules promouvoir à la fois la survie et la croissance des neurites de neurones in vitro de la SAG chiches 5,6.
Ici, nous décrire et démontrer la méthode in vitro nous sommes actuellement uchantent pour tester la réactivité des neurites SAG chiches aux protéines solubles, y compris morphogènes connus tels que les Wnts, ainsi que les facteurs de croissance qui sont importants pour la promotion de la croissance des neurites SAG et la survie des neurones. L'utilisation de ce système modèle, nous espérons pouvoir tirer des conclusions sur les effets que les ligands sécrétés peuvent exercer sur la survie des neurones SAG et la croissance des neurites.
Explants SAG sont disséqués au jour embryonnaire 4 (E4) et cultivées dans des gels de collagène en trois dimensions dans un milieu sans sérum pendant 24 heures. Tout d'abord, la réactivité des neurites est testé par des explants de culture avec des protéines complétés moyenne. Puis, de se demander si les sources ponctuelles de ligands sécrétés peuvent avoir des effets directionnels sur l'excroissance des neurites, les explants sont co-cultivées avec des billes recouvertes de protéines et analysés pour la capacité de la perle localement promouvoir ou inhiber le développement. Nous incluons également une démonstration de la dissection (modifié le protocole 7) et la culture des explants E6 moelle épinière. Nousutilisent couramment des explants de moelle épinière pour confirmer la bioactivité des protéines et protéines-trempés perles, et de vérifier les espèces réactivité croisée avec des tissus de poussins, dans les conditions même culture que les explants SAG. Ces tests in vitro sont pratique pour rapidement criblage de molécules qui exercent trophiques (survie) ou Tropic (directionnelle) effets sur les neurones du SAG, surtout avant d'effectuer des études in vivo. Par ailleurs, cette méthode permet de tester des molécules individuelles dans un milieu sans sérum, avec des neurones de survie élevé 8.
Protocole
Recettes
Ringers Chick
| 7,2 g | NaCl |
| 0,23 g | CaCl 2 + 2H 2 O |
| 0,37 g | KCl |
| 0,115 g | Na 2 HPO 4 |
| 900 ml | Eau (grade de culture de tissus) |
Remarque: Ajuster le pH à 7,4. Apportez un volume final de 1000 ml avec de l'eau.
PBS 10X
| 40 g | NaCl |
| 1 g | KCl |
| 7 g | Na 2 |
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Discussion
Nous présentons une méthode de disséquer et de la culture E4 SAG et E6 explants de la moelle épinière, de poussins, sous des conditions sans sérum. Cette procédure est actuellement utilisée dans notre laboratoire pour étudier les effets des différents ligands sécrétés sur la survie des neurones SAG et la croissance des neurites. De nouveaux aspects de ce protocole comprennent l'utilisation d'un système sans sérum pour les explants en culture et l'utilisation de billes trempées dans les facteurs de croissance.......
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Déclarations de divulgation
Pas de conflits d'intérêt déclarés.
Remerciements
Ce travail a été financé par les Instituts nationaux de la santé et de la Subvention RO1DC002756 Purdue Research Foundation. Nous tenons à remercier Doris Chang Wu et Wiese pour des conseils avec des expériences et McPhail Rodney à l'aide de chiffres.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Réactif | Société | Numéro de catalogue | Commentaire |
| Équipement | |||
| Microscope à dissection | Nous utilisons un Leica M80 stéréomicroscope avec éclairage fond clair de base | ||
| Glissez chauds | CS & E. | Collagène de polymérisation | |
| Oeuf de poule couveuse | |||
| 37 ° C / 5% de CO 2 humidifié incubateur de culture cellulaire | |||
| Matériaux Dissection | |||
| Sylgard &copie; revêtement boîte de Pétri | |||
| 24 puits, plaque de culture cellulaire | Corning | 3526 | |
| # 5 Dumont pince | Outils Fine Science | 11252-30 | |
| # 55 Pince Dumont | Outils Fine Science | 11295-51 | |
| Goupilles en acier inoxydable dissection | Outils Fine Science | 26002-10 | Embryon épinglage, la dissection fines |
| Moria cuillère perforée | Outils Fine Science | 10370-17 | La récolte des embryons / transfert |
| 200 pi larges embouts de pipettes bouche | Dot Scientific Inc | 118-96R | Le transfert des explants |
| E4 et E6 des oeufs de poule | & Nbsp; | ||
| Chick solution de Ringer | La récolte des embryons | ||
| HBSS | Sigma | H8264 | SAG dissection |
| Milieu L15 | Sigma | L5520 | Spinal moyenne de dissection du cordon |
| Sérum de veau fœtal | Atlanta Biologicals | S11150 | Spinal moyenne de dissection du cordon |
| Ciseaux Vannas | Instruments de précision du monde | 501778 | Dissection de la moelle épinière |
| Préparation de collagène | |||
| Collagène de type I de queue de rat | BD Biosciences | 354249 | La culture des explants |
| PBS 10X (stérile) | Pour neutralize collagène | ||
| NaOH 1N (stérile) | Pour neutraliser le collagène | ||
| L'eau distillée (stérile) | Pour neutraliser le collagène | ||
| papiers indicateurs de pH (de 6.0 à 8.1) | Whatman | 2629-990 | Pour vérifier le pH de collagène |
| 15 ml tubes coniques | Dot Scientific Inc | 818-PG | |
| 500 ul larges embouts de pipettes bouche | Dot Scientific Inc | 119-R100 | Pour collagène pipette |
| La culture des explants | |||
| DMEM/F12 | Sigma | D8437 | Milieu de culture des explants |
| SES 1 | Sigma | I2521 | Supplément de milieu |
| Pénicilline-streptomycine | Invitrogen | 15140-122 | Supplément de milieu |
| CNTF (rat) | Sigma | C3835 | Supplément de milieu |
| NT-3 (humain) | Sigma | N1905 | Supplément de milieu |
| Purifiée de souris Wnt5a | R & D Systems | 645-WN-010 | |
| Affi-gel perles de gel bleu | Bio-Rad | 153-7302 | |
| L'immunohistochimie | |||
| Paraformaldéhyde | Sigma | P6148 | Fixation |
| PBS | Rinçages | ||
| Triton X-100 | Sigma | T9284 | Solution de blocage |
| Sodiumazoture | Sigma | S8032 | Solution de blocage |
| De sérum de veau | Invitrogen | 16170-078 | Solution de blocage |
| Monoclonaux de souris anti-IgG2b β tubuline 1 + anticorps II | Sigma | T8535 | Les étiquettes des organismes cellulaires et neurites |
| Alexa Fluor 488 chèvre anti-souris IgG2 anticorps b | Invitrogen | A21141 | La tubuline β détecte les anticorps |
| Téflon micro spatule | VWR | 57949-033 | Des gels de collagène Libération de bien |
Références
- Fekete, D. M., Campero, A. M. Axon guidance in the inner ear. Int. J. Dev. Biol. 51 (6-7), 549-549 (2007).
- Fritzsch, B. Development of inner ear afferent connections: forming primary neurons and connecting them to the developing sensory epithelia.....
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Réimpressions et autorisations
