Application de la MassSQUIRM pour des mesures quantitatives de l'activité Déméthylase Lysine

Résumé

Nous présentons une méthode pour l'utilisation de la spectrométrie de masse MALDI et de la chimie méthylation réductrice pour quantifier les changements dans la méthylation de la lysine.

Résumé

Récemment, les régulateurs épigénétiques ont été découverts comme des acteurs clés dans de nombreuses maladies différentes ^1-3. En conséquence, ces enzymes sont des cibles de choix pour les études de petites molécules et ⁴ développement des médicaments. De nombreux régulateurs épigénétiques n'ont été que récemment découvert et sont encore en train d'être classés. Parmi ces enzymes sont déméthylases lysine qui éliminent des groupes méthyle de lysines sur les histones et autres protéines. En raison de la nature de cette nouvelle classe d'enzymes, des dosages peu ont été développés pour étudier leur activité. Cela a été un barrage routier à la fois la classification et l'étude à haut débit de déméthylases histones. Actuellement, des essais déméthylase il existe très peu. Celles qui existent ont tendance à être de nature qualitative et ne peut pas simultanément discerner entre les différents états de méthylation de lysine (non, mono-, di-et tri-). La spectrométrie de masse est couramment utilisé pour déterminer l'activité déméthylase, mais de masse actuels dosages par spectrométrie de fairepas non plus si les peptides différentiellement méthylés ioniser différemment. Ionisation différentielle de peptides méthylés permet de comparer les états de méthylation difficile et certainement pas quantitative (figure 1A). Ainsi des essais disponibles ne sont pas optimisés pour l'analyse complète de l'activité déméthylase.

Nous décrivons ici une méthode appelée MassSQUIRM (masse quantification par spectrométrie isotopique utilisant méthylation réductrice) qui est basé sur la méthylation réductrice de groupes amine avec le formaldéhyde deutéré pour forcer tous les lysines être di-méthylé, ce qui les rend essentiellement les mêmes espèces chimiques et donc ioniser l' même (figure 1B). La différence chimique seulement après la méthylation réductrice est de l'hydrogène et de deutérium, qui n'affecte pas l'efficacité d'ionisation MALDI. Le dosage MassSQUIRM est spécifique pour les produits de réaction avec déméthylase lysines non, mono-ou di-méthylés. Le dosage est également applicable aux méthyltransférases lysine donnant la SAmoi produits de réaction. Ici, nous utilisons une combinaison de la chimie méthylation réductrice et spectrométrie de masse MALDI pour mesurer l'activité de LSD1, une déméthylase lysine capable d'éliminer di-et mono-méthyle, sur un substrat peptide synthétique ^5. Ce test est simple et facile de les faire n'importe quel laboratoire d'avoir accès à un spectromètre de masse MALDI dans le laboratoire ou par l'intermédiaire d'une installation protéomique. L'essai a ~ 8 fois la plage dynamique et est facilement extensible à ⁵ format de plaque.

Protocole

Ce protocole est modifié de Blair et al. ^6.

1. LSD1 Assay déméthylation

1. Dans un volume final de 20 ul, mélanger 125 ng LSD1 recombinant avec 0,25 pg di-méthyl histone H3 peptide (ARTKme2QTARKSTGGKAPRKQLYK-biotine) dans un tampon déméthylase (50 mM Tris-Cl pH 8,5, KCl 50 mM, 5 mM MgCl _2, 5% glycérol). En outre, d'effectuer un contrôle peptide seul, sans enzyme. Le contrôle est de la section 3 et n'a pas besoin de méthylation réductrice.
2. Incuber pendant 2 heures à 37 ° C.
3. Pour recueillir les peptides, ajouter 8 ul POROS perles R2 microns de 20 à chaque échantillon et agiter pendant 15 minutes à température ambiante. Préparer perles POROS en suspendant 1 volume de perles avec 1 volume de méthanol, puis ajouter 10 volumes d'acide formique à 5% / TFA 0,2%.
4. Condition deux C ₁₈'
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Discussion

MassSQUIRM est une méthode peu coûteuse et quantitative pour l'analyse détaillée de l'activité de déméthylases lysine impliqués dans les mono-et di-méthylation. MassSQUIRM offre quantification non seulement du produit de la réaction, mais aussi pour les produits intermédiaires. Ce test peut être utilisé comme un outil puissant pour étudier le mécanisme de LSD1 et autres déméthylases histones. Il sera également utile pour classer les nombreuses enzymes nouvellement découverts déméthylase lysine comme PHF8 et pour...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Nom du réactif	Entreprise	Numéro de catalogue
LSD1	BPS Biosciences	50100
H3K4me2-biotine peptide	préparés à l'interne	aucun
POROS R2 20 perles micron	Applied Biosystems	1-1129-06
C 18 ZipTip	Millipore	ZTC18M
L'acide trifluoroacétique (TFA)	Thermo	28904
acétonitrile	Pêcheur	A996
Acide 2,5-dihydroxybenzoïque	Sigma	85707
Borane diméthylamine	Sigma	180238
isotopiquement lourd d 2-formaldéhyde	Cambridge Isotope Laboratories	DLM-805-20
Tris	Pêcheur	BP154
KCl	Pêcheur	BP366
MgCl 2	Pêcheur	BP214
Glycérol	Pêcheur	G33
L'acide formique	Fluka	06440
Le méthanol	Pêcheur	A452
Phosphate de Na	Pêcheur	BP329
Concentrateur SpeedVac	Savant	DNA110
MALDI-prOTOF spectromètre de masse et TOFworks logiciels	PerkinElmerSciex	aucun