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1. Isoler des cellules souches dérivées du tissu adipeux (ASC)
Remarque: Toutes les procédures ont été réalisées à température ambiante, sauf indication contraire.
- Isoler adipeux périrénal chez le rat et de l'épididyme et laver avec une solution stérile de Hank saline tamponnée (HBSS) contenant 1% de sérum de veau fœtal (FBS), comme décrit précédemment 6.
- Émincer le tissu et le transfert 1-2 g dans 25 ml de HBSS contenant 1% de FBS dans un tube de 50 ml et centrifuger à 500 g pendant 8 min à température ambiante.
- Recueillir la couche flottante du tissu adipeux et le transfert de 125 ml Erlenmeyer et traiter avec 25 ml de collagénase de type II (200 U / ml) dans du HBSS pendant 45 min à 37 ° C sur un agitateur orbital (125 rpm).
- Retirer soigneusement la fraction liquide (ci-dessous d'huile et de la couche adipeux) et filtrer séquentiellement à travers un filtre de maille en nylon 100-um et 70-um. Centrifuger le filtrat à 500 g pendant 10 min à température ambiante, aspirer le supernatant et laver le culot deux fois avec HBSS mL 25.
- Remettre en suspension le culot cellulaire dans 50 ml de milieu de croissance (MesenPRO RS moyen basal) supplémenté avec supplément MesenPRO croissance RS, antibiotiques antimycosiques (100 U / ml de pénicilline G, 100 ug / ml de sulfate de streptomycine, et 0,25 pg / ml d'amphotéricine B) , et 2 mM de L-glutamine et les cellules de pipette en 2 flacons T75 (25 ml / flacon).
- Culture de l'ASC dans un 5% de CO 2 incubateur humidifié à 37 ° C (Passage 2-4 ASC sont utilisés pour toutes les expériences).
2. Préparation Chitosan microsphères (CSM)
Remarque: Toutes les procédures ont été réalisées à température ambiante, sauf indication contraire.
- CSM sont préparés par un procédé de l'eau dans l'huile d'émulsification avec une technique de coacervation ionique à l'aide de notre précédente protocole n ° 6. Émulsionner une solution aqueuse de chitosane (6 ml de 3% p / v chitosane dans 0,5 M d'acide acétique) dans une 100 mL de mélange une phase huileuse comprenant de sojal'huile, le n-octanol (1:2 en volume / volume) et de 5% de sorbitan mono-oléate (travée 80) émulsifiant, en utilisant de tête (1700 tpm) et agitation magnétique (1000 tpm) simultanément, dans des directions opposées. Cette double méthode de mélange assure que les micelles formées très tôt, avant la réticulation se produit peut rester en solution et non pas se déposent au fond. En outre, l'agitation magnétique bar aides en de-agrégation chitosane lors de la formation de micelles et rigidification.
- Le mélange est agité en continu pendant environ 1 heure jusqu'à ce qu'une stable eau-dans-huile est obtenue. Réticulation ionique est initiée par l'ajout de 1,5 ml à 1% p / v d'hydroxyde de potassium dans du n-octanol toutes les 15 minutes pendant 4 h (24 totale ml).
- Après l'achèvement de la réaction de réticulation, lentement décanter la phase huileuse de la CSM mélange contenant et ajouter immédiatement les sphères à 100 ml d'acétone. Laver les sphères avec de l'acétone jusqu'à ce que la phase huileuse est complètement enlevé.
- Sécher les sphères récupérés dans un dessiccateur à vide et de l'anusYZE sans autre traitement. La taille moyenne des particules de CSM, la surface par milligramme et l'unité de volume cubique a été déterminée en utilisant un analyseur de taille de particules.
- Pour les expériences ultérieures, se laver trois fois avec du CSM de l'eau stérile pour éliminer les sels résiduels et stériliser à l'alcool absolu.
3. Détermination du nombre de groupes amino libres dans CSM
Remarque: Toutes les procédures ont été réalisées à température ambiante, sauf indication contraire.
- Déterminer le nombre de groupes amino libres présents dans CSM après réticulation ionique en utilisant le test trinitro benzènesulfonique (TNBS) de Bubins et Ofner 7. Incuber 5 mg de microsphères avec 1 ml de solution TNBS 0,5% dans un tube de 50 ml en verre pendant 4 h à 40 ° C et hydrolyser avec l'ajout de 3 ml de HCl 6N à 60 ° C pendant 2h.
- Refroidir les échantillons à température ambiante, et d'extraire les TNBS libres en ajoutant 5 ml d'eau déminéralisée et 10 ml d'éthyléther.
- Chauffer une partie aliquote de 5 ml de la phase aqueuse à 40 ° C dans un bain-marie pendant 15 min à s'évaporer toute l'éther résiduel, refroidir à température ambiante, et diluer avec 15 ml d'eau.
- Mesurer l'absorbance à 345 nm avec un spectrophotomètre utilisant une solution de chitosane TNBS sans que l'ébauche et le chitosane utilisé pour la préparation CSM pour déterminer le nombre total de groupes amino. Estimer le nombre de groupes amino libres du CSM par rapport au chitosane.
4. Chargement en ASC CSM
Remarque: Toutes les procédures ont été réalisées à température ambiante, sauf indication contraire.
- Equilibrer 5 mg de CSM stérilisés de l'article 2.5 dans HBSS stériles nuit et ajouter à un 8-um taille des pores membranaires insert plaque de culture (24-puits).
- Après le CSM se sont installés sur la membrane, aspirer délicatement les HBSS et ajouter 300 ul de milieu de croissance à l'intérieur de l'insert et 700 ul de milieu de croissance pour ee extérieur de l'insert.
- Resuspendre ASC à la concentration appropriée (1 x 10 4 à 4 x 10 4) dans 200 pi de milieu de croissance et de semences au cours de la CSM intérieur de l'insert plaque de culture. Le volume final du milieu au sein de l'insert de culture, après le semis, est de 500 pi.
- Incuber la tête de série ASC sur CSM pendant 24 h dans un 5% de CO 2 incubateur humidifié à 37 ° C.
5. Déterminer le pourcentage de chargement ASC et la viabilité cellulaire en CSM
Remarque: Toutes les procédures ont été réalisées à température ambiante, sauf indication contraire.
- Après incubation, la collecte du CSM ASC-chargée dans un microtube de 1,5 ml stérile sans perturber les cellules qui ont migré dans la membrane d'insertion.
- Retirez le milieu résiduel et ajouter 250 ul de milieu de croissance frais dans le tube.
- Pour chaque tube ajouter 25 ul MTT [3 - (4,5-dimethylthiozole-2-yl) -2,5-diphényltétrazolium]solution (5 mg / ml) et incuber pendant 4 h dans un 5% de CO 2 incubateur humidifié à 37 ° C.
- Après incubation, éliminer le milieu, ajouter 250 ul de diméthylsulfoxyde, et le vortex le mélange pendant 2-5 min pour solubiliser le complexe de formazan.
- Centrifuger le CSM à 2700 x g pendant 5 min, et de déterminer l'absorbance surnageant mesurée à 570 nm en utilisant 630 nm comme référence.
- Déterminer le nombre de cellules associée avec le CSM par rapport à la valeur d'absorbance obtenue à partir des numéros connus de l'ASC viable.
6. Caractériser ASC-CSM-Embedded gel de collagène
Remarque: Toutes les procédures ont été réalisées à température ambiante, sauf indication contraire.
- Mélange ASC-chargé CSM (5 mg contenant ≈ 2 x 10 4 cellules) avec collagène de type 1 (7,5 mg / ml) extrait à partir du tendon de queue de rat selon la méthode de Bornstein 8 et la fibrillation, après ajustement du pH à 6,8 à l'aide de NaOH 2 N.
Ajouter la fibrille collagène-ASC-CSM mélange sur une plaque de 12 puits et incuber pendant 30 min à une 5% de CO 2 incubateur humidifié à 37 ° C. - Après la fibrillation complète, incuber les gels de collagène-ASC-CSM pour un maximum de 14 jours dans un 5% de CO 2 incubateur humidifié à 37 ° C.
- Libération et migration de cellules de CSM dans le gel ont été observés en utilisant des techniques de microscopie standard.
7. Les résultats représentatifs
Dans la présente étude, nous avons développé une stratégie in vitro pour produire des cellules souches à partir de chitosane microsphères (CSM) dans un gel de collagène échafaud. CSM poreuse de taille uniforme (175-225 m de diamètre) et la composition ont été préparée et utilisée en tant que supports de cellules (figure 2). Sur incubation ASC avec le CSM, les cellules attaché à une concentration de 2 x 10 4 cells/5mg du CSM. Les cellules étaient capables de se propager au cours de la microsphère, tout en étendant filopodesdans les interstices de la microsphère poreux (figure 3). Une fois que le CSM cellule-chargé ont été mélangées avec le gel de collagène, les cellules immédiatement commencé migrer dans les gels (figure 4).
Tableau 1. Avantages biologiques pour l'utilisation de chitosane et de collagène dans un système de délivrance de cellules souches.
Figure 1. Schéma illustrant la stratégie globale de la double utilisation des ASC-CSM échafaudages de collagène chargés. Les figures 2, 3, et 4 sont annotés dans le schéma pour aider à l'interprétation des images.
Figure 2. Représentation schématique illustrant le processus d'ensemencement des cellules souches sur le chitosane microsphères. Le process implique la co-culture avec ASC CSM dans un 8 - um taille des pores de membrane plaque d'insertion de la culture. Après 24 heures, les microsphères sont retirés de l'insert et sont prêts pour l'enrobage dans une matrice biomatériau.
Figure 3. La caractérisation morphologique des CSM-chargé avec ASC. Groupe A représente la microscopie optique de ASC-chargé CSM, tandis que le panneau B montre le même champ de vision superposée à une image obtenue par microscopie confocale de fluorescence. ASC ont été préchargé avec calcéine AM (vert). Groupe C représente une image d'une image MEB d'une microsphère vide, tandis que le panneau D montre des cellules chargées sur la microsphère (astérisques). L'image TEM dans E panneau montre une section transversale d'un microsphère déchargé. Une multitude de pores et les fissures sont situées tout au long de la microsphère. Groupe F montre une microsphère coupe transversale avec des cellules (flèches) attaché et l'extension des filopodes dans le CREvices. Grossissements originales: A & B = 70X; C = 500x, D = 2.000 x; E & F = 2.500 x.
Figure 4. Migration des ASC du CSM dans l'échafaudage de collagène en trois dimensions. Les panneaux A et B représentent le CSM avec des cellules migrent d'microsphères et dans la matrice de collagène, le jour 3 (A flèches,). Le panneau B montre une culture similaire, après 12 jours. Microscopie électronique à transmission (TEM) des images sont représentées en C, D et E. Les astérisques en C et D montrent une microsphère qui a été coupe transversale avec des cellules migrent de la microsphère (flèches). Un plus fort grossissement du panneau D est représenté dans panneau E, et montre filopodes cellule attachée aux fibrilles de collagène (en médaillon). Le grossissement est de: A & B = 100x; C & D = 6.000 x; E = 20.000 x, encart = 150000 x.
Figure 5.Schéma illustrant les utilisations de vastes CSM en médecine régénérative et la livraison de drogue.