Dans cet article, nous décrivons vidéo l'utilisation d'une nouvelle Ex vivo Modèle de l'herpès simplex virus de type aiguës je cornée infection épithéliale.
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Article de méthode
Ex Vivo modèle organotypique cornéenne aiguë de l'herpès simplex virus type épithéliales je infection
Dans cet article
Résumé
Résumé
Kératite herpétique est une des pathologies les plus sévères associés au virus de l'herpès simplex de type 1 (HSV-1). Kératite herpétique est actuellement la principale cause de cécité cornéenne deux dérivés et associée à l'infection dans le monde développé. Présentation typique de kératite herpétique comprend également l'infection de l'épithélium cornéen et parfois le stroma cornéen profond et l'endothélium, conduisant à de telles pathologies cornéennes permanents comme des cicatrices, l'éclaircissage et l'opacité 1.
Cornée infection HSV-1 est traditionnellement étudiée dans deux types de modèles expérimentaux. Le modèle in vitro, dans lequel monocouches de culture de cellules épithéliales cornéennes sont infectées dans une boîte de Pétri, offre simplicité, niveau élevé de reproductibilité, des expériences rapides et des coûts relativement faibles. D'autre part, le modèle in vivo, dans lesquelles les animaux comme les lapins ou les souris sont inoculés directement dans la cornée, propose un état physiologique hautement sophistiquésystème, mais coûte plus cher, plus les expériences, les soins aux animaux nécessaires, et un plus grand degré de variabilité.
Dans cet article, vidéo, nous fournissons une démonstration détaillée d'un modèle ex vivo nouvelle épithélium cornéen infection HSV-1, qui combine les forces des deux in vitro et la le des modèles in vivo. Le modèle ex vivo utilise des cornées intactes organotypically maintenues en culture et infectées par le HSV-1. L'utilisation du modèle ex vivo permet de tirer des conclusions très base physiologique, mais il est assez peu coûteux et exige un engagement de temps comparable à celle du modèle in vitro.
Protocole
Tous les réactifs et du matériel ont été achetés stérile ou ont été stérilisés avant la procédure. Cet article décrit les étapes de mise en place du modèle ex vivo en commençant par un œil énucléé avant. Dans nos expériences, nous utilisons de nouveaux globes oculaires entières de jeunes (8-12 semaines) lapins albinos (Pel-Freez Biologicals, Rogers, AR). En outre, nous utilisons des cornées humaines obtenues à partir de la banque des yeux locale. Si vous effectuez vous-même l'énucléation, prenez soin de ne pas endommager la cornée ou du limbe lors de la procédure. Protocoles énucléation de lapin peuvent être trouvés ailleurs 2.
Partie 1: excision du bouton cornéosclérale
- Mouiller une étroite bande de gaze avec du PBS et l'enrouler autour du globe oculaire pour faciliter sa préhension lors de la procédure.
- Utiliser un scalpel pour faire une incision dans la sclère tangentielle, environ 0,5 cm du limbe.
- Utiliser des ciseaux bien aiguisés pour prolonger l'incision et complètement exciser la cbouton orneoscleral.
- Une fois sur le bouton cornéosclérale est isolé, loin taquiner l'iris tout en maintenant le bord scléral avec une pince. Éviter d'endommager l'endothélium ou exerçant un stress excessif sur la cornée.
Partie 2: Introduction de la cornée en culture organotypique
- Cornées explantées sont cultivées dans un milieu essentiel minimum (MEM) additionné de non-acides aminés essentiels (1X), L-glutamine (2 mM), la pénicilline (200 U / ml) et de streptomycine (200 ug / ml). Un agent antifongique, tels que l'amphotéricine, peuvent également être ajoutés si nécessaire.
- Préparer une solution à 1% d'agarose dans un milieu de culture et le tenir prêt à 55 ° C.
- Rincer soigneusement la cornée stérile pénicilline PBS contenant (200 U / ml) et de streptomycine (200 ug / ml).
- Placez le côté cornée épithéliale dans un puits d'une plaque à godets stérile.
- Ajouter le support d'agarose contenant de la concavité endothéliale de la cornée juste assez pourle remplir complètement. Permettez ~ 1 min pour le agarose à se solidifier.
- Placez la cornée avec le milieu de culture soutenir gel échafaudage côté épithélial vers le haut dans une boîte de culture tissulaire de 35 mm et d'ajouter à couvrir la surface épithéliale.
- La cornée peut être cultivé de cette manière depuis plus d'une semaine, avec tous les changements de milieu h 48.
Partie 3: L'infection par le HSV-1 et le traitement avec des médicaments expérimentaux
- Ajouter 1 ml de milieu contenant la quantité souhaitée de virus dans une boîte de culture de tissus 35 mm. En général, nous infecter avec 1x10 4 PFU de la souche KOS de HSV-1 par la cornée. Nos titres boursiers sont déterminés par des essais de plaque sur des monocouches de CV-1.
- Placer la cornée avec le côté échafaudage agarose épithéliale vers le bas dans le milieu contenant le virus.
- Placez la cornée dans un incubateur de culture tissulaire pour infecter pendant 1 heure avec balancement intermittent toutes les 10-15 minutes.
- Après 1 heure, aspirer le virus contaiNing moyennes et rincer 2-3 fois avec du PBS pour éliminer les particules résiduelles virales.
- Placer la cornée dans sa position précédente et ajouter un milieu de culture frais pour couvrir la surface de l'épithélium.
- Traitements expérimentaux peuvent être commencée avant ou après l'infection, en fonction de la nature de l'expérience.
- Le milieu de culture est changé tous les 48 h.
Partie 4: Prélèvement des échantillons
- Moyen pour l'analyse dosage de la plaque. Mélangez bien le support et l'utiliser immédiatement pour un essai de plaque ou de conserver à -80 ° C pour une utilisation ultérieure si la collecte d'échantillons à différents moments.
- ADN, ARN, protéines, ou des cellules de l'épithélium cornéen
- Retirer l'échafaud agarose et rincer la cornée et avec du PBS.
- L'excision de la bague de tissu scléral de la cornée afin de faire en sorte que seul matériau épithéliale cornéenne est recueillie.
- Uchanter un scalpel, gratter les cellules épithéliales cornéennes dans le tampon approprié, en fonction du type de matériau devant être isolé. Pour l'isolement de l'ADN et de l'ARN, on utilise le kit DNeasy Blood & Tissue et le kit RNeasy Mini, respectivement (QIAGEN, Hilden, Allemagne). Pour la collecte des lysats protéiques, nous utilisons tampon de Laemmli. Pour l'analyse par cytométrie en flux des cellules épithéliales cornéennes, nous pré-incuber les cornées dans une petite quantité de trypsine pour détacher les cellules, puis les déloger en trypsine avec un scalpel. Depuis racler l'épithélium cornéen ne donne pas des quantités égales de tissu, il est important d'inclure des contrôles appropriés lors de l'analyse des échantillons. Nous utilisons ARNr 18S comme une transcription de référence dans qRT-PCR, GAPDH comme gène de référence dans RCQP et nucléoline comme un contrôle de chargement pour Western blot.
- Des échantillons de tissus pour l'immunohistochimie ou immunofluorescence
- Retirer l'échafaud agarose et rincer le maïseo bien avec du PBS.
- En fonction de votre objectif expérimental, utilisez la cornée afin de faire un bloc de paraffine de tissu ou d'un bloc de tissu congelé, comme le montre la vidéo. Nous suivre les procédures standard lors de la préparation des coupes de tissus cornéens.
Les résultats représentatifs
La plupart des méthodes disponibles pour l'étude des cellules en culture de tissus peut être facilement adapté pour une utilisation dans la cornée in vivo infectées par le HSV-1 ex. On voit ici des résultats représentatifs pour quelques-unes des techniques les plus communes applicables à l'étude de l'infection HSV-1 - qPCR (figure 1D), qRT-PCR (figure 1B), Western blot (figure 1F), dosage de la plaque (figure 1C), et tissus par immunofluorescence (figure 1E).
Figure 1. Analyse des cornées infectées par le HSV-1 v exivo. Représentation schématique (A) du modèle ex vivo de épithéliale cornéenne aiguë infection HSV-1. (BF) Analyse des cornées infectées en utilisant la méthode décrite dans cet article la vidéo. Cornées de lapin explantés ont été infectées par le 1x10 4 UFP / cornée de souche KOS de HSV-1 et cultivées en présence (AAP) ou l'absence (Mock) d'acide phosphonoacétique (400 pg / ml), un inhibiteur connu de la réplication du HSV. (B) L'ARN total ont été recueillies aux points de temps indiqués, et la transcription virale a été évaluée par qRT-PCR avec des amorces pour le HSV-1 polymérase. Primaires contre l'ARNr 18S ont été utilisés comme référence. n = 3. Les barres d'erreur indiquent ± SEM. (C) Le milieu de culture a été recueilli à 48 hpi, et la production de particules infectieuses a été évaluée par dosage de plaque sur des monocouches de CV-1. (D) L'ADN total a été recueilli à 48 hpi, et la réplication du génome viral a été évaluée dans un test PCR quantitative avec des amorces pour le génome de HSV-1. PrIMERS contre GAPDH ont été utilisés comme référence. n = 3. Les barres d'erreur indiquent ± SEM. (E) Maquette cornées ont été traités par flash-gelé à 48 hpi, sectionnées et analysés par immunofluorescence indirecte pour la présence d'une protéine virale précoce (ICP8) dans l'épithélium infecté. Les noyaux sont contre-Höchst 33258. (F) lysats protéiques ont été recueillies à 48 hpi, et l'expression d'une protéine virale (ICP0) a été évaluée par Western blot. BCA a été utilisé pour assurer un chargement égal d'échantillons. hpi = heures après l'infection.
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Discussion
Dans cet article, vidéo, nous décrivons une méthode pour étudier aiguë épithélium cornéen infection HSV-1 dans un modèle ex vivo. Ce modèle est un tremplin utile entre le in vitro et dans des modèles in vivo de l', car elle permet de valider physiologiquement précise des résultats de culture cellulaire et, par conséquent, limite le montant de l'expérimentation animale qui doit être effectuée. En outre, le modèle ex vivo fournit une occasion unique et précieuse pour ét...
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Déclarations de divulgation
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Remerciements
L'appui de la Banque d'yeux des Lions du Delaware Valley a été inestimable pour ce travail. Anticorps de souris monoclonal primaire contre ICP8 était un gentil cadeau du Dr David Knipe (Harvard Medical School). Nous remercions également le Dr Stephen Jennings (Drexel University College of Medicine) et le Dr Peter Laibson (Wills Eye Institute) pour des discussions utiles et d'expertise.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Réactifs / fournitures | Entreprise | Catalogue # | |
| Minimum Essential Medium (MEM) | Mediatech | 10-010-CV | |
| Non-acides aminés essentiels (solution 100x) | Mediatech | 25-025-CI | |
| L-Glutamine | Mediatech | 25 à 005-CI | |
| Sel de sodium de pénicilline G | Sigma | P3032 | |
| Sel de sulfate de streptomycine | Sigma | S9137 | |
| Agarose | Invitrogen | 15510-027 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Préparé dans le laboratoire | N / A | |
| Trypsine EDTA (1x) | Mediatech | 25 à 053-CI | |
| Sang DNeasy Tissue Kit & | QIAGEN | 69504 | |
| RNeasy Mini Kit | QIAGEN | 74104 | |
| Tampon Laemmli | Préparé dans le laboratoire | N / A | |
| Température optimale de coupe (PTOM) composé | Tissue-Tek | 4583 | |
| Yeux lapin entier (Young) | Pel-Freez | 41211-2 | |
| Les cornées humaines et Yeux entiers | Banque des yeux locale | N / A | |
| 12 Plaque Bien spot Porcelaine | Alimentation de laboratoire d'Avogadro | 1877 | |
| Boîte de 35 mm Tissue Culture | Faucon | 353001 | |
| 6 BienPlaque de culture cellulaire | Greiner Bio-One | 657160 | |
| Cryomold intermédiaire | Tissue-Tek | 4566 |
Références
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- Holmberg, B. J. Enucleation of exotic pets. Journal of Exotic Pet Medicine. 16, 88-94 (2007).
- Remeijer, L., Osterhaus, A., Verjans, G. Human herpes simplex virus keratitis: the pathogenesis revisited. Ocul. Immunol. Inflamm. 12, 255-285 (2004).
- Foreman, D. M., Pancholi, S., Jarvis-Evans, J., McLeod, D., Boulton, M. E. A simple organ culture model for assessing the effects of growth factors on corneal re-epithelialization. Exp. Eye Res. 62, 555-564 (1996).
- Xu, K. P., Li, X. F., Yu, F. S. Corneal organ culture model for assessing epithelial responses to surfactants. Toxicol. Sci. 58, 306-314 (2000).
- Klausner, E. A., Peer, D., Chapman, R. L., Multack, R. F., Andurkar, S. V. Corneal gene therapy. J. Control Release. 124, 107-133 (2007).
- Halford, W. P. ICP0 antagonizes Stat 1-dependent repression of herpes simplex virus: implications for the regulation of viral latency. Virol. J. 3, 44(2006).
- Bhattacharjee, P. S. Effective treatment of ocular HSK with a human apolipoprotein E mimetic peptide in a mouse eye model. Invest Ophthalmol Vis. Sci. 49, 4263-4268 (2008).
- Novitskaya, E. S. Difficulties imaging herpes simplex keratitis with fluorescein isothiocynate-labeled anti-HSV-1 antibodies in an ex vivo model. Cornea. 28, 421-425 (2009).
- Sharma, A., Shimeld, C. In vivo immunofluorescence to diagnose herpes simplex virus keratitis in mice. Br. J. Ophthalmol. 81, 785-788 (1997).
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Réimpressions et autorisations
