Évaluer les changements métaboliques hépatiques pendant la colonisation progressive des axéniques de souris par 1 H NMR Spectroscopy

Résumé

Une procédure est décrite colonisation progressive pour mieux évaluer son impact sur le métabolisme hépatique hôte. La colonisation est surveillé non invasive, en évaluant l'excrétion urinaire de métabolites microbiens co-par RMN basée sur le profilage métabolique tandis métabolisme hépatique est évalué par la Haute Résolution angle magique (MAS RH) RMN de profilage intacte biopsie.

Résumé

Il est bien connu que les bactéries intestinales contribuent de manière significative à l'homéostasie hôte, offrant une gamme de prestations telles que la protection immunitaire et la synthèse de vitamine. Ils fournissent également l'hôte d'une quantité considérable de nutriments, ce qui rend cet écosystème un organe métabolique essentiel. Dans le contexte de plus en plus évident le lien entre la flore intestinale et le syndrome métabolique, la compréhension des interactions métaboliques entre l'hôte et sa microflore intestinale est devenue un enjeu important de la biologie moderne. ^1-4

Colonisation (appelé aussi processus de normalisation) désigne la création de micro-organismes dans une ancienne exempte de germes d'origine animale. S'il est un processus naturel survenant à la naissance, il est aussi utilisé chez les adultes sans germes animaux pour contrôler l'écosystème intestinal floraux et de mieux déterminer son impact sur le métabolisme de l'hôte. Une procédure commune pour contrôler le processus de colonisation est d'utiliser la méthode de gavage avec un single ou un mélange de micro-organismes. Cette méthode conduit à une colonisation très rapide et présente l'inconvénient d'être extrêmement stressant ^5. Il est donc utile de minimiser le stress et d'obtenir un processus plus lent de colonisation d'observer progressivement l'impact de la mise en place sur le métabolisme des bactéries hôtes.

Dans ce manuscrit, nous décrivons une procédure pour évaluer la modification du métabolisme hépatique au cours d'un processus de colonisation progressive en utilisant une technique non destructive métaboliques profilage. Nous proposons de suivre la colonisation microbienne intestinale en évaluant l'activité métabolique microbienne intestinale reflétée par l'excrétion urinaire de métabolites microbiens co-par ^une profilage métabolique par RMN H-fondée. Cela permet une appréciation de la stabilité de l'activité microbienne intestinale delà de l'établissement stable de l'écosystème microbien intestinal généralement évaluée par le suivi des bactéries fécales par DGGE (électrophorèse sur gel dénaturant gradient). ⁶ Lela colonisation se déroule dans un environnement ouvert et conventionnelles est initiée par une litière sale souillés par des animaux conventionnels, qui serviront de témoins. Les rongeurs sont des animaux coprophages, ce qui assure une colonisation homogène, comme décrit précédemment. ⁷

Profilage métabolique hépatique est mesurée directement à partir d'une biopsie du foie intact en utilisant ¹ H High Angle magique Résolution Spinning spectroscopie RMN. Cette technique semi-quantitative offre un moyen rapide d'évaluer, sans endommager la structure cellulaire, les principaux métabolites tels que les triglycérides, de glucose et de glycogène afin de mieux estimer l'interaction complexe entre les processus de colonisation et le métabolisme hépatique ^7-10. Cette méthode peut également être appliqué à toute une biopsie tissulaire ^11,12.

Protocole

1. La colonisation du germe sans animaux et la collecte de l'échantillon

1. Retirer les animaux sans germes d'isolateurs et de les héberger dans une salle de l'élevage dans des cages conventionnelles équipés d'un filtre à l'avant des animaux conventionnels qui servent de témoins (figure 1).
2. Mélanger la moitié de la litière (3 jours) prises de la cage de commande classique avec la litière des animaux sans germes. Toujours garder un tiers de la litière sale conventionnels chaque fois qu'il est nécessaire de le renouveler afin de maintenir un niveau de bactéries (il conserve pendant au moins 3 jours).
3. Recueillir l'urine dans un microtube de 1,5 ml par une manipulation de la souris sur le tube et aider à la miction par masser doucement l'intestin. Snap-geler immédiatement dans l'azote liquide. Stockez au moins à -40 ° C jusqu'à l'analyse par RMN. Un volume minimum de 20 uL est nécessaire pour l'acquisition d'une sonde RMN de 5 mm, mais il est recommandé d'utiliser 30 uL d'améliorer la qualité de profilage métabolique.
4. Les animaux doivent be euthanasié sans l'utilisation d'anesthésiques afin d'éviter les résonances RMN confusion due à un métabolisme hépatique de composés anesthésiques (par exemple, utiliser dislocation cervicale suivie d'une confirmation de la mort par exsanguination)

2. Recommandation pour la collecte de la biopsie du foie

1. Ne pas utiliser tout produit contenant de l'alcool pour éviter toute contamination. Laver les outils utilisant la solution d'eau ou une solution saline.
2. Ne pas percer la vésicule biliaire. En cas de fuite biliaire, laver immédiatement avec de l'eau des tissus ou de solution saline.
3. Recueillir des biopsies du foie (environ 15-50 mg) dans le lobe gauche, comme illustré dans la figure 2. Pour les biopsies reproductibles, de collecter de manière cohérente dans le centre du lobe gauche en évitant les zones périphériques où le tissu est plus mince.
4. Aligner les biopsies geler dans l'azote liquide immédiatement et les stocker à -80 ° C jusqu'à l'analyse par RMN.

3. ^RMN 1H acquisition de l'urine microvolume

Préparer 0,2 M solution de tampon phosphate de sodium dans D2O (99,8%), pH 7,4 contenant 1 mM 3 - (triméthylsilyl) d'acide propionique _4-D (TSP).

Mélanger 30 uL d'urine avec 30 uL de tampon phosphate de sodium.

Transférer 50 ul de solution mixte dans 1,7 mm RMN tube capillaire (figure 3 (2)) à l'aide d'une seringue en verre de 50 uL équipé d'une aiguille métallique (OD 0,5 mm). Soyez prudent pour éviter les bulles.

Monter l'adaptateur capillaire (Figure 3 (3)) sur le dessus de l'échantillon d'urine contenant des capillaires et le placer dans un microtube de 2,5 mm pour la RMN de 5 mm Sonde RMN (figure 3) (1). Utilisez cette combinaison de tubes en tant que régulier 5 mm pour tube RMN acquisition spectrale.

Utilisez la tige d'extraction (Figure 3 (4)) pour enlever les capillaires de 2,5 mm tube RMN en vissant l'adaptateur capillaires doucement pour la retirer.

. 4 ¹ H RMN HR MAS de tissu biopsie du foie: la préparation des échantillons

1. MAS composants du rotor et les outils sontdécrit dans la figure 4.
2. Insérer une biopsie (environ 15-50 mg) dans le rotor de zirconium (figure 4) (1) et remplissez le reste du volume avec pure O ₂ D pour la RMN serrure. Attention à ne pas faire remonter les bulles car cela altérer la qualité du calage ultérieur et la qualité de l'acquisition de données.
3. Insérer entretoise 50 uL Téflon (figure 4 (2)) en utilisant les vis cylindrique (figure 4 (5)). Dévissez et c'est calibrer en utilisant la jauge de profondeur sur le côté court (figure 4 (8)). À cette étape, il est important de prêter une attention particulière à l'échantillon, car une partie de cela peut fuir à travers le trou d'espacement. Si cela est le cas, alors une partie de la biopsie est détruit et le poids de l'échantillon n'est plus fiable. Il est donc nécessaire de recommencer depuis le début de la préparation de l'échantillon.
4. Placez la broche thead (figure 4 (3)) et vissez doucement avec le tournevis (figure 4 (6)). Sécher l'eau résiduelle avec un morceau de tissu.
5. Placez le couvercle (Figure 4 (4)) à lasupérieur du rotor et l'insérer dans l'emballeur du rotor (figure 4 (6)). Appuyez fermement jusqu'à ce que le bouchon est en place. Il ne doit pas être tout espace laissé entre le rotor et son capuchon.
6. Mark moitié de la partie inférieure du rotor en utilisant un marqueur noir pour permettre la détection optique de vitesse de rotation.
7. Placer le rotor à l'intérieur du spectromètre RMN et commencer à tourner à 5 kHz. Acquérir ^spectre RMN 1H utilisant CPMG séquence d'impulsions ^13, conformément aux directives du fabricant.
8. Utilisez la résonance α glucose anomérique à 5,22 ppm (doublet) pour calibrer les spectres RMN.
9. Pour déballer le rotor, procéder en enlevant le bouchon en utilisant le déménageur bouchon (figure 4 (9)). Dévissez et retirez thead broches téflon entretoise en utilisant la vis cylindrique. Laver abondamment à l'eau et de détergent.

5. Les résultats représentatifs

L'activité microbienne intestinale peut être contrôlée en utilisant le profilage métabolique urinaire. Un grand nombre de microbes urinairesco-métabolites identifiables ^par RMN 1H ont été décrits dans la littérature ^7,14-17. Ces microbes de co-métabolites sont particulièrement utiles pour surveiller le processus de colonisation car ils fournissent un moyen rapide et non invasive pour estimer quand l'écosystème nouvellement établie est stable. La figure 5A illustre clairement l'apparition d'microbienne intestinale co-métabolites sur le processus de colonisation. Cette figure montre un profil métabolique urinaire obtenu en suivant la procédure décrite à l'étape 2 pour un animal colonisé 20 jours en utilisant la procédure décrite à l'étape 1. Cet animal n'a pas excréter le sulfate de toute indoxyle et les montants très peu de phenylacetylglycine (PAG) et p-crésol sulfate à l'état de germe de frais (jour 0-bleu). Comme la colonisation progresse, ces trois marqueurs du métabolisme des protéines par le microbiote intestinal augmente considérablement pour atteindre un équilibre à jour 20 (rouge). Ceci est particulièrement facile à suivre pour un groupe d'animaux, comme illustré sur la figure 5B en utilisant le PAGrésonance. Ce diagramme a été obtenue en intégrant la surface sous les résonances surlignées en gris sur la figure 5A (δ 7,40 à 7,43), ce qui correspond à une résonance particulière (triplet) de GCP pour un groupe de 7 animaux.

¹ H à haute résolution Magic Angle Spinning (MAS RH) La spectroscopie RMN est une technique non destructive qui permet des acquisitions rapides et reproductibles de profils métaboliques de tout type de biopsie de ^{18 ans.} Dans ce protocole, nous avons utilisé cette technique puissante pour obtenir un profil métabolique hépatique de deux souris avant (bleu) et après (rouge) colonisation (figure 6). Ce chiffre illustre bien l'information qui peut être dérivé d'un profil métabolique RMN MAS-fondée. De nombreux acides aminés ainsi que des métabolites issus de métabolisme énergétique comme le glucose, le glycogène, le lactate, les triglycérides, (D)-3-hydroxybutyrate et nicotinurate peuvent être visualisées. Ces profils contiennent également des informations pertinentes au stress oxydatif (c'est à dire un ascorbiquecid, le glutathion), métabolisme des nucléotides (c'est à dire l'inosine, uridine) et le métabolisme de la méthylamine (c.-choline, la triméthylamine-N-oxyde). Dans cet exemple, il est très clair que le germe sans souris affiche presque pas de glycogène et de très faibles quantités de glucose et de triglycérides comme cela a été précédemment publiées ^7.

Figure 1. Présentation du protocole colonisation. Animaux axéniques et conventionnelles sont logés dans des cages équipées de filtres côté à côte et leurs portées sont échangées afin de permettre la colonisation progressive du microbiote intestinal conventionnel (1). L'activité microbienne intestinale est surveillé en utilisant ¹ H RMN profilage métabolique basé (2-3). Le métabolisme hépatique est évalué par ^une MAS RH H profilage métabolique par RMN basé (4-5).

Figure 2. Souris vivanteAnatomie r. Le foie est affiché comme du côté plat de l'orgue fait face à la table. Pour les biopsies reproductibles, il est conseillé de toujours prélever des échantillons à partir du centre du lobe gauche, comme indiqué par le rectangle en pointillés.

Figure 3 1,7 mm RMN kit capillaire pour travailler avec microvolumes clés:.. 1: 2,5 microtube RMN mm, 2: 1,7 mm RMN tube capillaire, 3: adaptateur capillaire, 4: tige d'extraction.

Équipements MAS Figure 4 rotors principaux:.. 1: rotor MAS, 2: 50 uL entretoise en téflon, 3: thead broches, 4: CAP, 5: Vis cylindrique, 6: tournevis, 7: rotor conditionneur, 8: jauge de profondeur.

Figure 5. Évolution des profils métaboliques urinaires durant colonization.

1. Zoom sur la région aromatique des spectres entre 6.8 à 7.8 ppm, où la co-métabolites microbiens peuvent être visualisées. Spectres RMN ¹ H ont été obtenues à partir d'un seul individu au jour 0 (bleu), 4 (vert), 15 (orange) et 20 (rouge) l'après-colonisation. La zone grise correspond à la zone qui a été intégrée pour rendre le schéma B. clés: 1-MeHistamine: 1-méthylhistamine; indoxyl-S: le sulfate de Indoxyl;:; Son p-crésol-S Histidine: le sulfate de p-crésol; PAG : Phenylacetylglycine.
2. La concentration moyenne durant la colonisation PAG (n = 7). T de Student-test a été utilisé pour comparer la différence de concentration en PAG à divers points de temps: a: p <0,05 par rapport au jour 0, b: p <0,01 par rapport à 10 jours.

Figure 6. Typique de 600 MHz ¹ H HR spectres RMN MAS de biopsies du foie provenant germ-free (en bleu) et ex-germ-free (red) les souris. Protons en gras sont responsables de la résonance de triglycérides clés:. 3-HB: 3-hydroxybutyrate, le GSH: glutathion réduit, TG: triglycérides, OTMA: triméthylamine-N-oxyde.

Discussion

Dans ce protocole, nous avons décrit une procédure de colonisation progressive dans un milieu ouvert aux autres d'étudier l'impact du microbiote intestinal sur le métabolisme hépatique évalué par ¹ H RMN HR MAS profilage des intacte biopsie. Diverses méthodes de la colonisation ont été décrits dans la littérature. Les méthodes les plus communes de coloniser les animaux avec un microbiote sont définis par gavage oral ou de l'eau potable contaminée ^19,20. L'inoculation fécale peut éga...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Nom du réactif	Société	Numéro de catalogue	Commentaires
2,5 mm microtube	Nouvelle ère	NE-H5/2.5-V-Br
1,7 mm tube capillaire	Sigma-Aldrich	NORS175001
Adaptateur capillaire	Nouvelle ère	NE-325-5/1.7
Extraction tige	Nouvelle ère	NE-341-5
HR-MAS BL4 rotor avec 50 pl sphériques kit entretoise en téflon	Bruker	HZ07213
Kit d'outils pour 50 inserts uL	Bruker	B2950
Advance III 600RMN MHz	Bruker
1 H RMN du solide HR MAS Sonde	Bruker
L'oxyde de deutérium 99,9%	Sigma-Aldrich	530867-1L
3 - (triméthylsilyl) propionique acide D-4 (TSP)	Sigma-Aldrich	269913