Les souris transgéniques ont été extrêmement utiles en attribuant la fonction physiologique des gènes. En tant que tel, la recherche en général, et les études fonctionnelles des voies respiratoires, en particulier, ont subi un changement remarquable vers des modèles murins. Ici, nous fournir des protocoles pour In vitro Les études de constriction trachée pour évaluer la fonction du muscle lisse des voies aériennes murin.
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Article de méthode
Les mesures in vitro de constriction trachéale l'aide de souris
Dans cet article
Résumé
Résumé
Transgéniques et des souris knock-out ont été des outils puissants pour l'étude de la physiologie et la physiopathologie des voies aériennes 1,2. Dans tensometry in vitro de préparations de trachées isolées s'est avéré être un test utile des voies respiratoires des muscles lisses (ASM) la réponse contractile des souris génétiquement modifiées. Ces préparations in vitro trachéaux sont relativement simples, une réponse énergique, et de conserver les deux fonctionnelles terminaisons nerveuses cholinergiques et les réponses musculaires, même après de longues incubations.
Tensometry trachéale fournit également une analyse fonctionnelle pour étudier une variété de voies de signalisation deuxième messager qui affectent la contraction du muscle lisse. Contraction dans la trachée est principalement médiée par les nerfs cholinergiques parasympathiques, qui libèrent l'acétylcholine sur l'ASM (Figure 1). Les principaux récepteurs acétylcholine muscariniques ASM sont M2 et M3, qui sont G i / o et Gq récepteurs couplés, respectivement 3,6,7. M2 / G i / o de signalisation est censé améliorer les contractions par l'inhibition de l'adénylate cyclase entraînant une baisse des taux d'AMPc 5,8,9,10. Ces voies constituent ce qu'on appelle le «pharmaco-contraction coupling" des voies respiratoires du muscle lisse 11. En outre, la signalisation par les récepteurs cholinergiques m2 (et modulée par M3 de signalisation) implique que les voies de dépolariser les ASM qui activent à leur tour de type L, les canaux calciques voltage-dépendants (Figure 1) et de l'afflux de calcium (ce qu'on appelle «couplage excitation-contraction" ) 4,7. Des études plus détaillées sur les voies de signalisation contrôlant la constriction des voies respiratoires peut être trouvé 4,12. Les voies ci-dessus semblent être conservée entre la souris et d'autres espèces. Toutefois, trachées de souris diffèrent des autres espèces in quelques voies de signalisation. La plus importante est leur manque de réponse contractile à l'histamine et adénosine 13,14, deux modulateurs connus ASM chez les humains et autres espèces 5,15.
Nous présentons ici des protocoles pour l'isolement des anneaux de la trachée et murins les mesures in vitro de leur production contractile. Des descriptions de la configuration de l'équipement, l'isolement anneau de la trachée et des mesures contractiles. Des exemples sont donnés pour évoquer les contractions indirectement en utilisant la stimulation haute de potassium de nerfs et directement par la dépolarisation du muscle ASM pour activer l'influx de calcium voltage-dépendants (1. Haute K +, figure 1). En outre, les méthodes sont présentées pour des stimulations de nerfs seules à l'aide une stimulation de champ électrique (2. EFS, figure 1) la stimulation, ou de dommage direct du muscle ASM en utilisant un neurotransmetteur exogène appliquée au bain (3. Exogène ACH, figure 1). Cette flexibilité et la facilité de préparation rend le modèle de bague isolée trachée un dosage solide et fonctionnelle pour un certain nombre de cascades de signalisation impliquées dans la contraction du muscle lisse des voies aériennes.
Protocole
1. Équipement
Les principaux composants d'un dispositif de mesure de contraction sont représentés schématiquement à la figure 2A).
- Un bain de tissu. Le bain de tissu maintient une solution physiologique oxygéné à l'eau tiède. Pour les anneaux de trachée de souris, nous utilisons un bain de 10 ml de tissu qui contient une chemise d'eau pour faire circuler une solution réchauffement, une entrée en verre fritté à l'oxygène bulle (95% / 5% O 2 / CO 2 mélange) et orifices d'entrée et de sortie pour changer des solutions. Une solution PSS réservoir est stockée avec barbotage d'constante de 95% / 5% de O 2 / CO 2 dans un mélange 37 ° C bain d'eau (non représenté). Pour l'échange de solution, la solution PSS est pompé depuis le réservoir à l'entrée bain de tissu (orifice inférieur) à environ 100 ml par minute afin de permettre l'échange solution relativement rapide. La sortie de solution passe par un port de débordement (premier port) qui permet à volume constant (~ 10 ml) de la chauve-souris des tissush lors de solution d'échange. Nous utilisons un circulateur de chauffage Haake pour pomper l'eau chaude à travers la chemise bain de tissu (pour maintenir 37 ° C). Bains de tissus peuvent être obtenus à partir d'un certain nombre de fournisseurs et viennent dans une variété de tailles et de styles pour répondre aux besoins expérimentaux de l'enquêteur.
- Un transducteur de force. Pour mesurer la tension isométrique, le tube est enfilé sur la trachée en forme de L extrémités de deux tiges d'acier inoxydable (figure 2A). Des précautions doivent être prises pour utiliser un type d'acier inoxydable qui est compatible avec du matériel biologique. La tige supérieure est reliée par l'intermédiaire d'un élément à un transducteur de force isométrique. La tige inférieure possède la trachée à une position fixe, et est monté sur un micromètre pour le réglage de la tension passive et / ou la longueur du muscle. Contraction de la trachée crée une tension sur le capteur de force, qui est converti en un signal de tension au préamplificateur. La tige inférieure peut également être configuré pour inclure deux plaques de platine rectangulaire (4 mm d'intervalle) t chapeau le flanc de la trachée (figure 2B). Les lames de platine sont reliés à un stimulateur herbe S88 qui permet la remise d'un champ électrique à travers la trachée. Fils à souder ouvertes et sont recouvertes d'Sylgard (élastomère de silicone Sylgard 184, Dow Corning Corp, Midland, MI), pour éviter le lessivage des métaux dans la solution de bain.
- Un convertisseur analogique / numérique, l'ordinateur et d'acquisition de logiciels. Signaux à partir des préamplificateurs sont enregistrées sur une MacLab 8 Un système / D. Il s'agit d'une version plus ancienne du matériel Powerlab ADInstrument actuelle. Nous utilisons le tableau des programmes (ADInstruments) qui permet l'enregistrement continu de la tension tout au long de l'expérience. Génération de tension du muscle trachée est assez lent, et c'est pourquoi nous trouvons que l'acquisition de 100 points par seconde est suffisant. La mesure de la tension est calibré à l'aide de poids connus (jusqu'à 5 grammes) avant chaque expérience. Des systèmes similaires sont disponibles à partir de vendeurs d'autres (par exemple, Biopac, Instruments GW).
- Avant l'isolement des tissus du capteur de force est calibré avec des poids connus, et le bain de tissu est rempli par le PSS normales (voir tableau I). L'entrée d'air est réglée pour obtenir un flux de lumière d'O 2 / CO 2.
- Les trachées de deux mois ou les souris plus âgées ne sont pas optimaux. Les jeunes animaux peuvent être utilisés mais trachées obtenus à partir de celles-ci exigent une plus grande habileté à monter sur les câbles du transducteur de force en raison de leur petite taille. Avant la dissection, les souris sont une sédation profonde avec l'isoflurane. Le bon niveau de sédation est atteint lorsque un orteil-pincement avec une pince n'est pas en mesure d'obtenir une réponse. Les souris sont immédiatement sacrifiés par dislocation cervicale Une remarque importante:. Nous avons observé que Avertin (tribromoéthanol), un sédatif fréquemment utilisé chez la souris, a de forts effets relaxants sur le muscle lisse bronchique et ne devrait donc pas être utilisé pour des études de contraction trachée.
- La peau (et de la fourrure) est enlevé du thorax à la gorge. Ribs sont coupés de la base du sternum, latéralement (des deux côtés) pour le haut du cœur. Le sternum et les côtes sont ensuite tirés vers l'avant à la gorge pour révéler le cœur / poumons, le thymus, la trachée (ventrale) et de l'œsophage (attaché à - et dorsale de la trachée).
- La trachée est excisé en coupant en dessous de la bifurcation des bronches et au-dessus du pharynx. La trachée est placé dans un bain de glace-froid oxygéné (95/5) solution PSS (composition donnée dans le tableau I).
- La trachée est disséqué propre des tissus environnants. Pendant le nettoyage, la trachée peut être tenue à l'pharynx ou au-dessous de la bifurcation. Toutefois, la prudence doit être prise de ne pas appliquer directement les forceps à la trachée elle-même. Des ciseaux fins peuvent être utilisés pour couper les tissus environnants, mais la coupe doit toujours être faite parallèlement à la trachée pour éviter tout dommage. Cette partie de la procédure est facilitée si la préparation trachée est épinglé ci-dessous et au-dessus de la bifurcation du pharynx sur un plat recouvert de Sylgard (Sylgard 184 en siliconeÉlastomère, Dow Corning Corp, Midland, MI).
- Après avoir retiré les tissus environnants, la trachée est coupée ci-dessous le pharynx et dessus de la bifurcation des bronches et délicatement monté sur des fils capteur de force.
- La trachée est enfilé sur deux broches métalliques en forme de L (figure 2A). Une broche est connectée à un transducteur de force-déplacement pour l'enregistrement continu de la tension isométrique. Une autre broche est reliée à un micromètre. Le bain de tissu est ensuite soulevé de telle sorte que la trachée est immergé dans PSS. Montage de la trachée doit être fait aussi rapidement que possible afin de minimiser le temps que la trachée ont lieu en dehors de la PSS. Avec la pratique, le montage de la trachée peut être fait en une minute, mais nous évitent généralement de fois plus longtemps que 3 minutes pour éviter la perte de la viabilité.
- Le micromètre est ajusté progressivement pour obtenir une tension passive de ~ 10 mN (~ 1 gramme-force). La tension optimale de repos a été déterminé de manière empirique et nous avons constaté que la tension passive de ~ 5 à 10 résultats mN à un équivalent, la réponse maximale à la stimulation élevée en potassium. Ceci est cohérent avec un certain nombre d'autres études qui utilisent une tension passive dans cette gamme de 16,17,18. Au cours des 5-10 premières minutes, de la trachée tension passive tend à diminuer quelque peu (relaxation de contrainte phénomène) et le micromètre est utilisé pour ajuster la tension passive à ~ 10 mN pendant l'équilibrage. La trachée est autorisé à s'équilibrer pendant au moins 1 heure avant défis expérimentaux.
3. Haut de stimulation de potassium
Après équilibration, la trachée est contestée à deux reprises avec une solution de potassium PSS élevé (67 mM de KCl, Tableau I). La contraction nécessite généralement quelques minutes ~ 5-10 pour atteindre l'état d'équilibre au cours de laquelle le bain tissu est rincé plusieurs fois avec PSS normales de se détendre complètement la trachée. La contraction de potassium est répétée une seconde fois, et une troisième fois (si nécessaire) jusqu'à ce que les contractions reproductibles sont obtenus.
4. Contraction évoquée par une stimulation électriqueLa trachée est flanquée de deux plaques rectangulaires platine (électrodes) qui permettent une stimulation de champ électrique (AEF) à la préparation. La réponse contractile à AEF est une fonction de fréquence et de tension. Il est également affecté par des paramètres physiques tels que la zone des électrodes et la distance entre eux. Les caractéristiques de puissance du stimulateur également influer sur les réponses telles que des tensions plus élevées et les sorties actuelles du stimulateur peut atteindre son maximum. Les caractéristiques de tout système EFS doit être déterminé en examinant les réponses musculaires contractiles à différents durées de relance, les fréquences, les tensions et les durées d'impulsions. Pour notre configuration expérimentale, nous avons constaté que des électrodes séparées par ~ 4 mm et l'amplitude de stimulation de 44 V (0,5 ms impulsions) et 30 Hz sont optimales pour atteindre reproductibles quasi-maximales réponses contractiles.
5. Ev Contractionoked par stimulation cholinergique
La réactivité de la trachée au exogène composés appliqués est évaluée soit par addition d'une dose unique du médicament d'intérêt ou, par des ajouts multiples de la drogue d'une manière dose cumulée. Pour la trachée, notre laboratoire couramment utilisés carbachol pour activer les récepteurs cholinergiques, car, contrairement à l'acétylcholine, le carbachol n'est pas dégradée par l'acétylcholinestérase. Une relation dose-réponse raisonnable durée est comprise entre 10 -8 à 10 -5 M carbachol. Montage de la Connexion [carbachol] courbe de réponse contractile avec une équation de Hill de type permet une estimation de CE 50 (la moitié du maximum de concentration efficace) qui est une mesure de la sensibilité de la contraction trachéale à l'agoniste cholinergique 19. Il est à noter que pour une dose donnée de carbachol donnera une réponse un peu plus en une seule dose que dans le cadre d'une courbe dose-réponse cumulative.
6. Les résultats représentatifs
Un exemple de réponse contractile à haute teneur en potassium est indiquée sur la figure 3A. La contraction atteint un maximum dans les 10 minutes environ, mais peut présenter une légère baisse par la suite. Au cours de lavage au début de la haute teneur en potassium, le muscle peut montrer une augmentation transitoire de la contraction qui est due à une baisse de température que le petit volume de solution PSS non chauffé dans les lignes solution transitoire perfuse la préparation. Ceci peut être minimisé en ayant un minimum de volume mort dans la tubulure reliant le réservoir PSS chauffée et bain de tissu, et aussi par l'échange d'une solution assez rapidement (en général, nous pomper des solutions à 100 ml / min). Chaque préparation aura des différences dans la réponse contractile à cause de différences dans la masse musculaire ou des dommages subis lors de la dissection. Figure 3B montre deux trachées de la masse musculaire différente contestée avec haute teneur en potassium et le carbachol. Bien que les contractions cholinergique-évoqués diffèrent, ley sont similaires après la normalisation de la réponse avec une solution riche en potassium (figure 3C).
La figure 4 montre un exemple de carbachol (cholinergique) la contraction évoquée en utilisant des doses uniques (A) et une augmentation cumulative (B). Les solutions carbachol sont ajoutés directement au bain et le gaz barboter aide de mélange rapide. Il est à noter que l'ajout d'une dose unique (c.-à-1 uM, la figure 4A) a une réponse légèrement plus grande que la concentration équivalente au cours d'une dose-réponse cumulative courbe (1 uM, figure 4B). 4C figure montre une parcelle de la force de contraction en fonction de concentrations de carbachol à partir de données de figure 4B. Effets de carbachol saturer à 10 -5 M de concentration. Bien que les agonistes cholinergiques provoque la contraction grâce à des mécanismes de libération du calcium, un élément important de la contraction est également médiée par la dépolarisation et del'activation des canaux calciques voltage-dépendants 20.
La figure 5A montre un exemple de EFS-évoqués contractions. Les trachées sont stimulés à l'aide 0,5 milliseconde durée, 40 impulsions volts jusqu'à ce que les contractions atteignent un plateau (voir encadré A1). Une augmentation de la fréquence de stimulation provoque une augmentation de la réponse contractile (réponse en fréquence courbe est tracée sur la figure 5B). Une stimulation de champ électrique a été montré pour évoquer principalement les contractions en activant les nerfs présynaptiques. Ceci est démontré par l'effet de la toxine botulique, un bloqueur de la libération de neurotransmetteurs qui bloque la majorité des contractions EFS-évoqués de la trachée 21. En outre, la tétrodotoxine, un agent qui bloque les canaux Na + inhibe également l'activité nerveuse et élimine la réponse de la trachée à EFS.
Figure 1. Schéma de til voies de signalisation majeures dans une préparation trachée isolée. Montré est un terminal axone cholinergique innervant une cellule musculaire lisse trachéal. Les voies de signalisation majeures sont-M3 et M2-muscariniques l'activation des récepteurs acétylcholine (mAChR) qui provoquent la libération de calcium par les récepteurs IP3 (M3) et la réduction de l'AMPc (M2). Récepteurs M2 (et une certaine contribution des récepteurs M3) aussi provoquer une dépolarisation cholinergique-évoqué qui active canaux de type L dépendant de la tension de calcium et de l'afflux de calcium. Communes agents contractiles et leurs effecteurs sont: 1. haute teneur en potassium (dépolariser la cellule musculaire lisse et des axones cholinergiques), 2. une stimulation de champ électrique (EFS, dépolarise cholinergique axone) et 3. application exogène d'agents cholinergiques tels que l'acétylcholine ou carbachol (active les récepteurs muscariniques directement).
Figure 2. Schéma de l'équipement utilisé pour mesurer les contractions trachéales. A. Le capteur de force, d'un micromètre et un bain de tissu sont montés sur tiges de support via bornes à vis. L'anneau trachéal est enfilé sur les tiges supérieures et inférieures. Dans le diagramme, le bain de tissu est positionné au-dessous de la préparation (soit lors du montage de la trachée sur le transducteur de force). Au cours des études de contraction, le bain de tissu est déplacé verticalement de se baigner à la préparation. B. pour la stimulation de champ électrique la tige inférieure est modifié pour inclure deux lames de platine qui sont montés latéralement sur le fil de maintien trachée. Les lames de platine sont reliés par des fils électriques à un stimulateur.
Figure 3. Exemples de haute teneur en potassium (67 mm) la réponse contractile de la trachée. (A) montre en double, des réponses reproductibles à haute teneur en potassium. (B) Exemples de réponse contractile à la carbachol de deux trachées différents. (C) Les réponses aux trachées dans B sont similaires lorsque normaliserd à la réponse haute de potassium.
Figure 4. Exemples de contractions induites par le carbachol. (A) carbachol contractions induites par l'aide de doses uniques suivi par un lavage. (B) Exemple cumulatif courbe dose-réponse de la trachée chez A. (C) des contractions de pointe de B sont tracées en fonction de la concentration de carbachol.
Figure 5. Exemples de contractions provoquées par une stimulation de champ électrique. (A) une stimulation de champ électrique de la contraction la trachée à l'aide d'impulsions de 0,5 ms, 40 volts, et des fréquences de stimulation différentes, comme indiqué. Insert à temps dilaté contraction à 30 Hz. (B) des contractions maximales de A sont Plotted en fonction de la fréquence de stimulation.
PSS normales
| Sel | Conc. (MM) | Montant (g / 2 L) |
| NaCl | 119 | 13,91 |
| KCl | 4.7 | 0.7 |
| KH 2 PO 4 | 1,18 | 0,32 |
| MgSO 4 7H 2 O x | 1,17 | 0,58 |
| NaHCO 3 | 18 | 3,02 |
| EDTA | 0,026 | 0,1 ml de 0,5 M |
| Glucose | 11 | 3,96 |
| Saccharose | 12,5 | 8,56 |
| CaCl 2 | 2 | 400 ml de 10 mM |
High K + PSS (NaCll et ajustements KCl)
| Sel | Conc. (MM) | Montant (g / 2 L) |
| NaCl | 56,7 | 6,628 |
| KCl | 67 | 9,991 |
. Tableau 1 Recette des solutions PSS. Remarque: Les solutions sont fait frais par semaine, avec de l'eau de qualité ultrapure, et sont stockés dans un réfrigérateur pendant plus de 5 jours pour éviter de contaminer la croissance.
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Discussion
Le protocole présenté ici fournit une préparation physiologique pour évaluer la fonction musculaire des voies respiratoires. Nous fonctionnent généralement 3-4 préparations pour le bain d'organes en même temps, cependant, les systèmes préemballés sont disponibles à partir d'un certain nombre de fournisseurs qui permettent des mesures simultanées de jusqu'à 8 préparations (ADInstruments, instruments de précision du monde, et Harvard Apparatus). Nous avons utilisé un certain nombre de capteurs de force et des ...
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Déclarations de divulgation
Pas de conflits d'intérêt déclarés.
Remerciements
Ce travail a été financé par une subvention du Centre pour l'innovation en matière de prévention et de traitement des maladies respiratoires, des subventions du NINDS (NS052574), et du Programme de recherche sur l'asthme Sandler pour.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Nom du réactif | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
| Convertisseur analogique-numérique | ADInstruments | PowerLab 4/35 | |
| Carbachol (chlorure de Carbamoylcholine) | Sigma-Aldrich | C4832 | 10 -2 M dans de l'eau (aliquotes peuvent être stockés à -20 ° C) |
| Logiciel de Graphiques | ADInstrtuments | LabChart | |
| Circulateur chauffage | Haake | Mixer Mill MM400 | |
| Capteur de force isométrique | Kent scientifique | TRN001 | |
| Stimulateur | Technologies de gazon | S88 Squ Dual Outputsont Pulse stimulateur | |
| Bain de tissus | WPI | 47264 |
Références
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