Le test neuroblaste: Un test pour la génération et l'enrichissement des cellules souches neuronales à partir de différenciation des cellules souches neurales Progeny Par cytométrie en flux

Résumé

Ce protocole vidéo démontre une nouvelle méthode pour la génération et la purification ultérieure des cellules progénitrices neuronales à partir d'une source renouvelable de cellules souches neurales (CSN) en fonction de leur physique (taille et granularité interne) et les propriétés fluorescentes en utilisant la technologie de cytométrie en flux.

Résumé

Les cellules souches neurales (CSN) peuvent être isolés et élargi à grande échelle, en utilisant le test neurosphères et différenciés dans les trois principaux types de cellules du système nerveux central (SNC); à savoir, les astrocytes, oligodendrocytes et des neurones. Ces caractéristiques font de souches neurales et les cellules progénitrices une source inestimable renouvelable de cellules pour des études in vitro, tels que le dépistage des drogues, neurotoxicologie et l'électrophysiologie et aussi pour la thérapie de remplacement cellulaire dans de nombreuses maladies neurologiques. En pratique, cependant, l'hétérogénéité de la descendance NSC, la faible production de neurones et des oligodendrocytes, les astrocytes et la prédominance de la suite de différenciation limiter leurs applications cliniques. Ici, nous décrivons une nouvelle méthodologie pour la purification de production et subséquente des neurones immatures de NSC descendance murin utilisant la fluorescence tri cellulaire (FACS) de la technologie. En utilisant cette méthodologie, une population hautement enrichi de cellules souches neuronales peuvent être atteints d'espritHout toute astrocytes notable et de bonne foi la contamination NSC. La procédure comprend la différenciation des produits de filiation du NSC isolé et agrandi à partir de E14 éminences ganglionnaires de souris en utilisant le test neurosphères, suivie par l'isolement et l'enrichissement de cellules immatures neuronaux en fonction de leurs propriétés physiques (taille et la complexité interne) et fluorescente utilisant la technologie de cytométrie en flux. Dans l'ensemble, cela prend 5-7 jours pour générer neurosphères et 6-8 jours pour différencier descendance NSC et d'isoler hautement purifié des cellules neuronales immatures.

Protocole

1. Basic Set Up Avant de procéder à la culture cellulaire

1. NeuroCult NSC milieu de base et les suppléments NeuroCult NSC prolifération sont mélangés à un rapport 9:1, respectivement, de faire du milieu complet NSC.
2. Un bain à 37 ° C est utilisée pour réchauffer le milieu.
3. Quantité appropriée de inactivé par la chaleur sérum de veau foetal (FCS) est décongelé.
4. Quantité appropriée de solutions d'achat d'actions du facteur de croissance, y compris le facteur de croissance épidermique (EGF à 10 pg / ml), le facteur de croissance fibroblastique (b-FGF à 10 pg / ml) et 0,2% solution d'héparine dans un tampon phosphate salin (PBS) sont décongelés.
5. Flacons de culture cellulaire (T25, T75 ou T175 &) sont nécessaires à l'expansion et la différenciation NSC.
6. La culture de tissus traités 96 et 24 plaques à puits et des lamelles de verre sont nécessaires pour le placage cellules triées.

2. Isolement, et l'expansion (repiquage) de NNC

1. Souches neurales et progéniteurs sont isolés et élargi de la souris bpleuvoir comme décrit dans les protocoles distincts ^{1, 2 3.}
2. Lorsque le neurosphères (neurosphères primaires ou passages) sont prêts pour sous-culture (150-200 m de diamètre), les sphères milieu contenant est transféré à une taille stérile tube approprié la culture de tissus, et centrifugé à 800 tours par minute (110 g) pendant 5 min à température ambiante.
3. Le milieu surnageant est éliminé et les sphères sont remis en suspension dans 1 ml de pré-chauffé à 0,05% de trypsine-EDTA.
4. Après incubation à 37 ° C bain d'eau pendant 2-3 min, un volume égal d'inhibiteur de trypsine de soja est ajouté à la suspension de cellules pour arrêter l'activité de la trypsine.
5. Pour veiller à ce que la trypsine a été complètement inactivé, la suspension cellulaire est doucement introduit à la pipette de haut en bas 3-5 fois.
6. Après centrifugation à 800 rpm (110 g) pendant 5 min, le surnageant est éliminé et les cellules sont remises en suspension dans 1 ml de milieu complet NSC.
7. 10 ul de la suspension cellulaire est mélangé avec 90 pl de trypanosomiasen bleu pour effectuer un comptage des cellules.
   Remarque: D'autres dilutions de cellules appropriées peuvent également être utilisés.
   
8. Les cellules sont ensuite utilisés pour les repiquages ^{​​1, 2} ou de différenciation tel que décrit ci-dessous.

3. Différenciation des souches neurales et cellules progénitrices, le dosage des neuroblastes (NBA)

1. Cellules résultant d'une neurosphères dissociées sont étalées à une concentration de 2-3 x 10 ⁵ cellules / ml dans le milieu complet NSC additionné de 20 ng / ml EGF, 10 ng / ml de bFGF, 1 pl / ml d'héparine de 0,2% et 5% FCS inactivé par la chaleur dans un flacon de culture taille du tissu approprié. 5 ml de milieu est utilisé pour T25, 20 ml pour T75 et T175 40 ml pour flacons.
   Note: FCS fera les cellules à fixer solidement au substrat et il n'est pas nécessaire pour le revêtement des flacons pour la culture NBA.
   
2. Culteure flacons sont ensuite incubées à 37 ° C incubateur humidifié avec 5% de CO ₂ pour 3-4 jours. Cette période est appelée phase de prolifération, au cours de laquelle descendance NSC attacher au substrat et de proliférer en monocouche de cellules.
3. Quand la culture devient confluente 90-95%, le milieu de chaque flacon est allumé au milieu complet NSC supplémenté avec 5% de FCS sans facteurs de croissance.
4. Des flacons de culture sont à nouveau incubées à 37 ° C incubateur humidifié avec 5% de CO ₂ pour un autre 3-4 jours. Cette période est appelée stade de différenciation, au cours de laquelle progéniteurs neuronaux apparaissent au-dessus d'une monocouche astrocytaire et prolifèrent pour faire des colonies de cellules immatures neuronales. Sur 4-5 jours de stade de différenciation, la culture est prêt pour l'isolement des cellules neuroblastes en utilisant la technologie de cytométrie en flux.

4. Préparation des cellules pour cytométrie en flux

Trypsinisation

1. La culture de la différenciation descendance NSC sur 4-5 jours de stade de différenciation est lavée une fois avec une quantité appropriée de PBS (2 ml pour T25, 4 ml pour T75 et 8 ml pour T175 flacon) pour enlever FCS de la culture.
   Note: FCS blocs de trypsine-EDTA activité.
   
2. Puis, une quantité suffisante d'préchauffée 0,05% de trypsine-EDTA (2 ml pour T25, T75 4 ml pour et 8 ml pour T175 flacon) est ajouté à chaque fiole pour couvrir la monocouche de cellules et incubation pendant 1-2 min dans un 37 ° C incubateur humidifié.
3. Le ballon est contrôlé sous le microscope pour évaluer l'effet de la trypsine-EDTA sur la culture. Le ballon est alors tenu d'une main et frappé fermement avec l'autre main pour déloger les cellules du fond de la fiole.
4. Volume égal d'inhibiteur de trypsine de soja est ajoutée au récipient pour étancher activité de la trypsine. La suspension cellulaire est doucement introduit à la pipette de haut en bas pour assurer l'inactivation de la trypsine et d'atteindre une cellule homogène uniquela suspension.
   Remarque: Vous pouvez milieu supplémenté avec 5% de FCS pourrait être utilisé pour étancher activité de la trypsine.
   
5. Pour supprimer non dissociés touffes, la suspension cellulaire est passé à travers un filtre à mailles de 40 um de taille.
6. La suspension cellulaire est ensuite centrifugé à 800 tours par minute (110g) pour 5 min, le surnageant est éliminé et les cellules sont remises en suspension dans un volume approprié de milieu complet NSC.
7. Le volume final de la suspension cellulaire est ajusté de telle sorte que la densité de cellules ne dépasse pas 2-3x10 ⁶ -cells/ml. Haute densité cellulaire pourrait causer un blocage flux dans la machine cytométrie en flux.
8. Si vous souhaitez isoler des cellules neuronales simplement en fonction de leurs propriétés physiques, vous pouvez maintenant procéder à tri par FACS comme décrit dans la partie 4.
9. Avant le triage, l'iodure de propidium (PI, Sigma, 500 pg / ml dans du PBS) est ajouté à une concentration de 1 pl / ml de suspension cellulaire à exclure les cellules mortes.

Vivez cell immunomarquage

Pour parvenir à une plus grande pureté des cellules neuronales, récolté seule cellule de la culture NBA peut être teinté pour PSA-NCAM (un marqueur de début immatures progéniteurs neuronaux), puis les cellules positives de la population neuronale peut être isolé en utilisant la machine FACS.

1. Après avoir effectué un comptage des cellules, la suspension cellulaire unique à partir de la culture NBA est divisé en quatre groupes:
   • Cellules de groupe, seuls sert de contrôle pour ajuster les paramètres et Gates (0,5-1 x 10 ⁶ cellules).
   • Les cellules ainsi que PI, sert de témoin pour ajuster les paramètres et Gates (0,5-10 x 10 ⁶ cellules). Cellules pi négatif de ce groupe peut également être triés en fonction des caractéristiques physiques des cellules.
   • Secondaire seul (Isotype groupe témoin) qui sert également un contrôle pour ajuster les paramètres et les portes (1-2 x 10 ⁶ cellules).
   • Immunomarquage groupe (8-10 x 10 ⁶ cellules) qui est taché de PSA-NCAM pour atteindrepurification des cellules immatures neuronales. Pour exclure les cellules mortes sur le tri, PI est ajouté à ce groupe ainsi.
2. Pour commencer immunomarquage, les cellules sont centrifugées à 800 tours par minute (110 g) pendant 5 min. Le surnageant est éliminé et les cellules sont remises en suspension dans 100 ul de milieu complet NSC.
3. Phycoérythrine (PE) conjugué anti-PSA-NCAM anticorps est ajouté à un rapport de 10 ul / 5-10 x 10 ⁶ cellules à la suspension cellulaire à être colorés pour PSA-NCAM. De la même manière, un PE de la souris conjugué anticorps IgG1 isotype contrôle est ajouté à la suspension cellulaire isotype contrôle. Suivez les instructions sur la feuille de spécifications concernant les anticorps de la concentration d'anticorps pour être utilisé. La suspension cellulaire est ensuite mélangés doucement et incubés à température ambiante pendant 10-15 min dans l'obscurité.
4. Les suspensions cellulaires (PSA-NCAM et les tubes de contrôle isotype) est ensuite centrifugé à 800 tours par minute (110 g) pendant 5 min, le surnageant est éliminé et les cellules sont ré-suspended dans 1 ml de milieu complet NSC.
5. Pour éliminer l'excès non bornées anticorps à partir des échantillons, étape 4 est répétée 2-3 fois.
6. Après remise en suspension des cellules dans un volume approprié de milieu, l'iodure de propidium (PI, Sigma, 500 ug / ml dans du PBS) est ajouté à une concentration de 1 ug / ml des suspensions cellulaires (cellules plus PI, isotype de contrôle et de PSA- NCAM-tachées échantillons) pour exclure les cellules mortes après avoir été analysées par cytométrie de flux.
7. 15 ml stériles tubes Falcon contenant 1 ml de milieu complet sont prêts à recueillir des cellules triées à partir de différentes populations cellulaires.

5. Le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) des neurones immatures

1. La machine FACS est mis en place en fonction de son manuel d'instructions utilisateur via le technicien en cytométrie en flux expert installation.
2. Tampon phosphate salin (PBS) ou de toute autre solution appropriée depending sur les instructions du fabricant, peut être utilisé comme fluide de gaine à 28 PSI à travers une buse 90 um.
3. De pression différentielle sur le système est réglé de telle sorte que le taux de déclenchement de tri ne dépasse pas 2500 événements par seconde.
4. La suspension de cellules provenant des cellules seules groupe est dirigé par la machine FACS.
5. Tout d'abord, les cellules (les événements) sont tracées en fonction de leur taille (Forward Scatter (FSC) de lumière) par rapport à la complexité interne (Side Scatter (SSC) de lumière) pour distinguer les différentes populations cellulaires. Pour ce faire, les paramètres de tension pour le FSC et SSC devrait être ajustée de sorte que les cellules peuvent être vu dans le complot cytométrie en flux.
6. Pour exclure amas de cellules et pourpoints, les cellules sont d'abord tracées fondé sur la superficie diffusion vers l'avant (FSC-A) par rapport à l'avant de largeur d'impulsion de dispersion (FSC-W) et la population seule cellule est fermée alors que la population 1 (P1). Ensuite, les cellules P1 sont tracées en fonction de la superficie dispersion latérale (SSC-A) par rapport à la largeur d'impulsion côté de dispersion (FSC-W) et cette fois les cellules individuelles sont gated que la population 2 (P2). Après avoir établi ces deux portes consécutives, des touffes ou des doublets (haute largeur d'impulsion FSC et SSC haute largeur d'impulsion) sont exclus.
7. Pour exclure les cellules mortes ou endommagées, les cellules individuelles (P2) sont tracées sur la base de la réactivité par rapport à PI FSC-A et la population seule cellule vivante est fermée.
8. Simple cellules vivantes sont tracées sur la base de FSC par rapport SSC de distinguer différentes populations de cellules basées sur la taille des cellules et la granularité interne. A ce stade, deux populations de cellules principales sont déclenchés par le FSC ^{faible faible} SSC (P3) et FSC ^haute SSC ^élevé (P4) des populations de cellules.
9. Pour trier PSA-NCAM immuno-réactifs cellules neuronales immatures de la FSC SSC ^{faible densité de} population ^faible, le premier FSC population SSC ^{faible faible} du contrôle (cellules ainsi que PI et isotype contrôle) des groupes est tracée à partir immunoréactivité PE par rapport FSC-A et le négatif cellules sont déclenchés (P5), puis les cellules positives de PSA-NCAMgroupe teinté sont déclenchés alors que la population 6 (P6).
10. Après ajustement toutes les portes nécessaires, les cellules d'intérêt sont classés en 15 ml stériles tubes de culture de tissus contenant 1ml NSC moyennes.
11. Les cellules triées sont ensuite centrifugés à 1200 rpm (240 g) pendant 5 min.
12. Le surnageant est éliminé et le culot est remis en suspension dans un volume approprié de milieu (en fonction de la taille des granulés) et une numération cellulaire est effectuée.
13. Les cellules sont ensuite étalées dans du Poly-L-ornithine enduits plaques à 96 puits à une densité de 20-30 x 10 ³ cellules / puits dans 200 à 250 pi de NSC milieu complet avec 5% de FCS et 20 ng / ml humaine recombinante BMP4 ⁵ .

Remarque: pour enrober 96 puits, 100 pi de poly-L-ornithine solution de travail (1,5 ml Poly-O et 8,5 ml de PBS stérile) est ajouté à chaque puits et la plaque est incubée dans un incubateur à 37 ° C pendant au moins un heures. Ensuite, le Poly-O est éliminé et chaque puits est lavé trois fois avec du PBS stérile(Laisser le PBS restent dans le puits pendant 10 min à chaque fois). Utilisez 500 pl de poly-L-ornithine solution de travail / bien si des plaques 24 puits sont utilisés.

14. Les cellules sont ensuite fixées à différents moments après l'espèce par le froid du paraformaldéhyde à 4% et immunocolorées pour marqueurs appropriés de cellules neuronales et gliales pour évaluer le phénotype de cellules triées à partir de différentes populations cellulaires.

6. Les résultats représentatifs

Dans la culture neuroblaste test de différenciation (NBA), les cellules plaquées joindre au substrat de culture tissulaire et de grandir comme une monocouche. Selon la densité des cellules de placage initial, la culture va se transformer en une culture de 90-95% de confluence après 3-4 jours. A ce stade, une monocouche de cellules astrocytaires principalement peut être visualisée à l'aide de petits sous rondes cellules progénitrices neuronales sur ^4,5 supérieur (Figure 1). Après la commutation du moyen à un milieu sans facteur de croissance, des cellules progénitrices neuronales commencerdivisant rapidement et produisent des amas de cellules immatures neuroblastes sur le dessus de la monocouche astrocytaire en 4-5 jours (Figure 2). L'analyse par cytométrie en flux de la NBA la culture dissociée sur 4-5 jours de stade de différenciation, montre deux populations de cellules principales; FSC ^faible SSC ^faibles et FSC ^haute SSC ^élevée basée sur la taille des cellules (FSC) et la granularité interne (SSC) (figure 3). Immuno-analyse fluorescente des cellules triées montre que les cellules neuronales se situent principalement dans les populations FSC SSC ^{bas que bas} (avec plus de 75% d'entre eux exprimant β-tubuline III), tandis que les cellules triées de la population FSC SSC ^{haute haute} sont pour la plupart GFAP astrocytes immunoréactifs (Figure 4). Une purification supplémentaire de cellules immatures neuronales jusqu'à homogénéité près (97%) pourrait être atteint avec la sélection positive des cellules IR PSA-NCAM de la population FSC SSC ^{faible faible} (Figure3, 4). Enrichi cellules neuronales générées par les CNS isolés à partir de E14 éminences ganglionnaires de souris d'acquérir un phénotype GABAergique et expresse DARPP-32, un marqueur des neurones épineux moyens, lors de la différenciation (Figure 5).

Figure 1. La culture test de neuroblastes E14 cellules souches neurales de souris au jour 4 de phase de prolifération. Cette culture monocouche se compose de plats cellules astrocytaires (flèches) en dessous et autour des cellules progénitrices neuronales (flèches) sur le dessus. Le grossissement est de 20; x.

. Figure 2 la culture test de neuroblastes E14 cellules souches neurales de souris au jour 4 de stade de différenciation: Un contraste de phase), B) coloration par immunofluorescence. Notez le groupe de cellules immatures neuronales (flèches dans A et β tubuline coloration III B) sur le dessus de la monocouche astrocytaire (têtes de flèches dans une coloration, GFAP dans B). Le grossissement est de 20; x.

. Figure 3 parcelles de tri représentatifs: A). FSC vs SSC parcelle sorte avant l'exclusion de doublets et les cellules mortes. B, C). Parcelles de tri pour l'exclusion de doublets fondés sur FSC et SSC de largeur d'impulsion. D). Exclusion de cellules mortes et endommagées fondée sur immunoréactivité iodure de propidium. E). FSC vs SSC parcelle après l'exclusion de doublets et les cellules mortes, montrant les deux principales populations étiquetées comme la ^faible FSC ^faible SSC et les FSC ^fortes populations de la SSC ^élevés. F, G). Trier les parcelles d'isoler PSA-NCAM cellules immatures IR de la population FSC SSC ^{faible faible.}

Micrographies représentatives Figure 4. À partir de cellules triées de différentes populations un jour après placage. A) FSC ^faible SSC ^{faible densité de} population (plus de 75% de ces cellules sont des neurones). B) FSC ^haute SSC ^{élevée de la} population (la majorité de ces cellules sont les astrocytes ). C) PSA-NCAM ^{+ de} cellules triées à partir de FSC ^faible SSC ^{faible densité de} population (la quasi-totalité des cellules triées sont des neurones). Agrandissement d'origine, 20 x.

Figure 5. Tri neurones immatures se différencier en neurones GABAergiques (A) et express DARPP-32 (B), un marqueur de neurones épineux moyens.

Discussion

La capacité d'isoler des populations définies de cellules neurales (neurones à savoir, astrocytes et oligodendrocytes) pourrait résoudre certains des obstacles associés à l'application clinique des cellules souches neurales (CSN). Tout d'abord, il nous permet de caractériser complètement la population de départ de cellules du donneur. Deuxièmement, il nous permet d'utiliser un type cellulaire particulier ou une combinaison de différents types de cellules avec un rapport spécifique, en fonction de la natu...

Matériaux

Nom du réactif	Type	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
NeuroCult NSC moyen basal	Moyen	Technologies des cellules souches	05700
NeuroCult NSC suppléments prolifération	Supplément moyen	Technologies des cellules souches	05701
0,05% de trypsine-EDTA	Réactif	Gibco	25300-062
Inhibiteur de trypsine de soja	Réactif	Sigma	T6522
Pen / Strep	Réactif	Gibco	15140-122
* MEM	Réactif	Gibco	41500-018	Composante HEM
* Les HEPES	Réactif	Sigma	H4034	Composante HEM
* L'eau distillée	Réactif	Gibco	15230-147
Tamis cellulaire	Tamis	BD Falcon	352340
T25 flacon	Culture de la céramique	Nalge Nunc internationale	136196
T80 flacon	Culture de la céramique	Nalge Nunc internationale	178905
Tubes de 15 ml	Culture de la céramique	BD Falcon	352096
Tubes de 50 ml	Culture de la céramique	BD Falcon	352070
EGF	Facteur de croissance	R & D	2028-EG
b-FGF	Facteur de croissance	R & D	3139-FB
Héparine	Facteur de croissance	Sigma	H4784	Reconstitué dans du PBS
Anti-PSA-NCAM-PE	Anticorps	Miltenyi Biotec	130-093-274
IgG1 souris PE-conjugué	Anticorps de contrôle isotypique	BD Pharminogen	556029
Héparine	Facteur de croissance	Sigma	H4784	Reconstitué dans du PBS
PMOrh-4	Facteur de croissance	R & D	314-BP-010
Poly-L-Ornithine	Réactif	Sigma	P4957
Sérum de veau foetal	Supplément moyenne	Gibco	10099-141
GFAP	Anticorps	DAKO	Z0334
B-III tubuline	Anticorps	Promega	G7121

* Pour faire HEM, mélange 1 sachet x L 10 du MEM et 160 ml de HEPES 1M et porter le volume à 8,75 L avec de l'eau distillée. Réglez le pH final à 7,4 et le conserver à 4 ° C.