TransFLP - Une méthode pour modifier génétiquement Vibrio cholerae Basé sur la transformation naturelle et FLP-recombinaison

Résumé

Une méthode rapide pour modifier le génome d' V. cholerae Est décrite. Ces modifications incluent la suppression de gènes uniques, des clusters de gènes et îlots génomiques ainsi que l'intégration de séquences courtes (par exemple des éléments de promoteur ou par affinité tag séquences). La méthode est basée sur la transformation physique et FLP-recombinaison.

Résumé

Plusieurs méthodes sont disponibles pour manipuler les chromosomes bactériens ^1-3. La plupart de ces protocoles reposent sur ​​l'insertion des plasmides réplicatifs conditionnelle (par exemple abriter des réplicons pir-dépendants ou sensibles à la température ^1,2). Ces plasmides sont intégrés dans les chromosomes bactériens basés sur l'homologie médiée par recombinaison. Ces mutants d'insertion sont souvent utilisés directement dans des cadres expérimentaux. En variante, la sélection pour l'excision du plasmide suivie par la perte peut être effectuée, pour laquelle les bactéries Gram négatif dépend souvent de l'enzyme contre-sélectionnable sucrase lévane codée par le gène sacB ^4. L'excision pouvez restaurer le génotype de pré-insertion ou le résultat d'un échange entre le chromosome et la copie plasmidique du gène modifié. Un inconvénient de cette technique est qu'elle prend beaucoup de temps. Le plasmide doit être cloné premier, il nécessite de transfert horizontal V. cholerae la plupart (n otably par accouplement avec un E. coli souche donneuse) ou artificielle transformation de celui-ci, et l'excision du plasmide est aléatoire et peut soit restaurer le génotype initial ou créer la modification souhaitée si aucune sélection positive est exercée. Ici, nous présentons une méthode pour la manipulation rapide de l'V. chromosome cholerae (s) ⁵ (figure 1). Cette méthode est basée sur TransFLP la chitine récemment découvert à médiation par induction de compétence naturelle dans cette organisme représentatif ⁶ et d'autre du genre Vibrio tels que V. fischeri ^7. Compétence naturelle permet l'absorption de l'ADN libre, y compris des fragments d'ADN générés par PCR. Une fois pris, l'ADN recombine avec le chromosome étant donné la présence d'un minimum de 250-500 pb de la région flanquante homologue ^8. Comprenant un marqueur de sélection entre-deux de ces régions adjacentes permet une détection facile des transformants fréquentes. t "> Cette méthode peut être utilisée pour différentes manipulations génétiques de V. cholerae et potentiellement d'autres bactéries naturellement compétentes. Nous fournissons trois exemples de nouvelles sur ce qui peut être accompli par cette méthode, en plus de notre étude précédemment publiée sur les suppressions monogéniques et le plus d'affinité tag séquences ^5. Plusieurs étapes d'optimisation concernant le protocole initial de la chitine induite par la transformation naturelle ⁶ sont intégrés dans le présent protocole TransFLP. Ceux-ci comprennent entre autres le remplacement des fragments de coquilles de crabe en flocons disponible dans le commerce chitine ^8, le don de la PCR dérivée d'ADN transformant en matériau ^9, et l'ajout de sites cibles FLP-FRT recombinaison () ^5. sites FRT permettre l'excision dirigée vers le site du marqueur de sélection par l'intermédiaire de la recombinase Flp ^10.

Protocole

La méthode TransFLP (figure 1) est illustrée par trois approches différentes: I) la suppression de deux gènes adjacents codant pour des déterminants de virulence de V. cholerae (par exemple, ΔctxAB), ii) l'élimination d'un îlot de pathogénicité (par exemple, ΔVPI-1), et iii) l'intégration d'une séquence T7 polymérase dépendante de l'ARN promoteur en amont d'un gène d'intérêt, ce qui permet par la suite de son expression artificielle dans le fond souche respective (par exemple, T7-TFox) (figure 2).

1. Préparation des flocons de chitine

1. Poids 50-80 mg de flocons de chitine dans un tube en plastique standard de 1,5 ml. Cela peut être préparé en vrac. Flocons de chitine sont disponibles dans le commerce auprès de Sigma (cat. nombre C9213).
2. Autoclaver les flocons de maintien des couvercles des tubes ouverts.
3. Immédiatement fermer les paupières après l'autoclave est refroidi.
4. Magasin autoclavé flocons de chitineà la température ambiante.

2. Option: Transformation artificielle de V. cholerae avec la recombinase FLP plasmide codant

1. Préparer électrocompétentes V. cellules cholerae utilisant des méthodes standard ^11. Stocker des aliquotes de cellules compétentes à -80 ° C.
2. Ajouter 1-2 pl d'une mini-préparation régulière de plasmide pBR-flp ⁵ à la électrocompétentes V. cholerae et transférer les cellules du mélange dans une cuvette d'électroporation (0,2 cm largeur de l'intervalle).
3. Appliquer une impulsion de 1,6 kV.
4. Ajouter 0,9 ml milieu SOC, doucement transfert de cellule à une norme de tube 14 ml. Incuber non mobile de 2,5 à 3 h à 30 ° C.
5. Plaque 100 ul et 300 ul sur des plaques LB contenant 100 ug / ml d'ampicilline et incuber à 30 ° C pendant la nuit.
6. Purifier clone unique et l'enregistrer comme stock de glycérol pour des expériences futures TransFLP.

3. Conception oligonucléotide et Polymerase Chain Reaction

1. Au moins six oligonucléotides sont nécessaires pour amplifier la région d'ADN (s) d'intérêt ainsi que la FRT-cassettes antibiotique flanqué par PCR (figure 3). Il est recommandé d'inclure également une paire d'amorçage oligonucléotides en dehors du fragment inséré PCR. Cela permet de vérifier l'intégration et l'excision correcte de la cassette FRT-flanqué de résistance aux antibiotiques (par exemple, décrit comme «chk-up 'et les amorces« chk-down »dans les figures 3 à 5).
2. Concevoir des oligonucléotides # 2, # 3, # 4 et # 5 avec soin. Ils devraient être en mesure de suffisamment recuit (par exemple, ~ 28 pb) à la matrice d'ADN. La matrice d'ADN est un ADN génomique (ADNg) pour les amorces n ° 2 et n ° 5 et FRT-Kan-FRT contenant l'ADN plasmidique comme pROD17 ¹² et pBR-FRT-KAN-FRT (cette étude) pour les amorces # 3 et # 4 ( La figure 3A).
3. Concevoir des amorces # 2 à # 5 permettant vaste appariement de bases à leur extrémité 5 'entre # 2 / # 3 et # 4 / # 5, respectivement (figure 3A encadré). Deux cycles de PCR suivre.
4. Effectuer trois réactions PCR indépendantes comme un 1 ^er tour de la PCR. La première sera amplifier la région en amont du gène / ADN région d'intérêt à l'aide d'oligonucléotides N ° 1 et N ° 2. La PCR devrait se traduire par un fragment d'au moins 500 pb de longueur pour permettre la recombinaison homologue dans les cellules. Des fragments plus courts (~ 250 pb) peut être de ⁸ suffisante, mais ne sont pas recommandés.
5. En parallèle effectuer la deuxième PCR qui amplifie la cassette FRT-flanqué antibiotique. Pour les exemples fournis ici, nous avons surtout utilisé aph (kan ^R). Oligonucléotides utilisation n ° 3 et n ° 4 pour cette réaction (figure 3A).
6. De façon concomitante, amplifier la région d'ADN en aval par PCR (troisième échantillon). Le fragment de PCR devrait également être d'au moins 500 pb de longueur. Effectuer la PCR avec ADNg comme matrice et les oligonucléotides # ​​5 et # 6 (figure 3A).
7. Après purification PCR de tous les troisfragments, effectuez la 2 ^ème tour de la PCR. Utilisez un mélange à parts égales de chacun des trois fragments obtenus au premier tour en tant que modèle. L'amplification est catalysée par des oligonucléotides n ° 1 et n ° 6. Le fragment obtenu par PCR (figure 3B) sert de l'ADN transformant dans l'expérience la transformation naturelle (figure 1).

4. La chitine induite par la transformation naturelle

1. Cultivez V. cholerae cellules en aérobiose dans un milieu riche à 30 ° C jusqu'à ce qu'ils atteignent une densité optique à 600 nm d'environ 0,5.
2. Récolter les bactéries par centrifugation. Laver à granulés une fois dans un milieu artificiel défini (DASW ⁶⁾ avant de remettre en suspension les cellules dans 2 volumes de DASW. Ajouter 1 ml de culture à 50-80 mg de flocons stériles chitine (expliqué au point 1). Si les bactéries port plasmide pBR-flp (facultatif point 2), ajouter l'ampicilline (50 ug / ml) à la culture. Incuber à 30 ° C pendant 16-24 heures sans mouvement.
3. Ajouter & ge, 200 ng de la 2 ^e ronde PCR dérivé fragment (expliqué au point 3). Mélanger soigneusement sans beaucoup détacher les bactéries de la surface de chitine. Incuber à 30 ° C pendant 24 heures sans mouvement.
4. Vortex de la culture extensive de ≥ 30 sec. Fais 100-300 ul sur des plaques de milieu LB sélectif (par exemple la kanamycine ou des plaques LB contenant de la gentamicine pour les exemples fournis ici). Utilisez deux plaques sélectives si les bactéries abriter le plasmide pBR-flp en ajoutant à l'ampicilline en association aux autres antibiotiques. Incuber les plaques à 30 ° C pendant 16-24 heures ou jusqu'à ce que les colonies sont visibles.
5. Isoler transformants simples à partir de plaques sélectives. Ces transformants ont remplacé le lieu d'origine chromosomique par le fragment de PCR en raison d'un événement croisée en double. Ces souches peuvent être directement utilisés pour d'autres expériences dans le cas où le retrait de la cassette antibiotique n'est pas nécessaire.

5. Retrait de la cassette sélectif (s) par Flp-Recombinaison

1. Artificiellement transformer vos transformants avec le plasmide pBR-flp comme décrit au point 2 s'il n'est pas effectué avant l'essai de transformation naturelle.
2. Cultiver les bactéries sur des plaques de gélose LB contenant de l'ampicilline à 37 ° C pendant 16-24 heures. Options: changer la température dans l'intervalle de 2-3 heures à 40 ° C comme expression de flp à partir du plasmide pBR-de-flp est réprimée à ^5,10 températures plus élevées, bactéries transfert aux plaques fraîches après env. 8 heures d'incubation.
3. Test de sensibilité aux antibiotiques (montré ici pour la kanamycine; figure 1) par restreaking les clones en parallèle sur des plaques d'agar contenant des antibiotiques et sans antibiotique. Isoler simples colonies sensibles. Congelez résistant à l'ampicilline clone comme stock de glycerol si vous avez l'intention de modifier encore la souche avec suppression autre / d'insertion en utilisant TransFLP.

6. Curage du plasmide

1. Développer la culture du jour au lendemain dans des conditions aérobies età 30 ° C. Utilisez un milieu riche sans l'addition d'un antibiotique.
2. En option: croissance de culture frais pour 3-6 heures par dilution de la culture d'une nuit 1:100 en eau douce milieu sans antibiotique.
3. Dilution plaque ou série (s) de la culture sur plaque LB agar plaine (s) et incuber à 30 ° C pendant 8-16 heures (jusqu'à ce que les colonies sont visibles).
4. Test de sensibilité à l'ampicilline des clones par restreaking les clones en parallèle sur des plaques de gélose contenant l'antibiotique et sans antibiotique (figure 1). Geler l'ampicilline souche sensible que les stocks de glycérol.

Résultats

Les résultats représentatifs des trois exemples sont présentés dans les figures 4 à 6. La première approche vise à supprimer les gènes voisins ctxA et ctxB. Ensemble, ils codent le facteur de virulence majeur de V. cholerae, la toxine cholérique. Nous avons conçu des oligonucléotides pour la méthode TransFLP comme décrit ci-dessus et conformément à la figure 3. La souche parentale, la souche intermédiaire hébergeant FRT de la cassette de résistance aux antibio...

Discussion

La méthode décrite ci-dessus et TransFLP ailleurs ⁵ a été largement utilisée dans notre laboratoire. Le genre de manipulations génétiques qui sont réalisables comprennent entre autres: la suppression de gènes individuels et groupes de gènes, la suppression des îlots génomiques (par exemple, VPI-1), l'insertion de séquences en amont d'un gène d'intérêt (par exemple, des séquences promotrices) et l'insertion de séquences à la fin d'un gène spécifique (par exemple, ...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Nom du réactif	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Flocons de chitine	Sigma	C9213	Autoclavage nécessaire
OPTION: Micropulser (en boîtier de cassette antibiotique doit être excisée par la recombinase Flp codé sur pBR-flp)	Biorad	165-2100	Ou électroporateurs comparables