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Article de méthode

La salive, les glandes salivaires, et Collection hémolymphe de tiques Ixodes scapularis

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DOI :

10.3791/3894

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21 février 2012

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1Microbiology and Pathogenesis Activity, Bacterial Diseases Branch, Division of Vector-Borne Diseases, National Center for Emerging and Zoonotic Infectious Diseases, Centers for Disease Control and Prevention, 2Tick-Borne Diseases Activity, Bacterial Diseases Branch, Division of Vector-Borne Diseases, National Center for Emerging and Zoonotic Infectious Diseases, Centers for Disease Control and Prevention

Dans cet article

Résumé

La collection de l 'hémolymphe tique infectée, des glandes salivaires et la salive est important d'étudier comment les tiques agents pathogènes causent la maladie. Dans ce protocole, nous montrer comment recueillir les glandes salivaires et l'hémolymphe de se nourrir Ixodes scapularis Nymphes. Nous démontrons également le prélèvement de salive de la femelle I. scapularis Les adultes.

Résumé

Les tiques se trouvent dans le monde entier et affligent les humains avec de nombreuses maladies transmises par les tiques. Les tiques sont des vecteurs d'agents pathogènes qui causent la maladie de Lyme et fièvre récurrente à poux (Borrelia spp.), Rocky fièvre pourprée des montagnes (Rickettsia rickettsii), l'ehrlichiose (Ehrlichia chaffeensis et E. equi), l'anaplasmose (Anaplasma phagocytophilum), l'encéphalite (tic- virus de l'encéphalite transmise par), de la babésiose (Babesia spp.), de la fièvre à tiques du Colorado (Coltivirus), et la tularémie (Francisella tularensis) 1-8. Pour être correctement transmis à l'hôte de ces agents infectieux différentielle réguler l'expression génique, interagir avec des protéines de tiques, et migrent à travers la tique 3,9-13. Par exemple, l'agent de la maladie de Lyme, Borrelia burgdorferi, s'adapte à travers l'expression différentielle des gènes aux stades de fête et de la famine de cycle enzootique de la tique 14,15. En outre, comme une tique Ixodes consomme unerepas de sang Borrelia reproduire et migrer de l'intestin moyen dans le hémocèle, où ils se rendent aux glandes salivaires et sont transmis à l'hôte avec la salive expulsées 9,16-19.

Comme une tique se nourrit de l'hôte répond généralement avec une forte réponse immunitaire innée et hémostatique 11,13,20-22. En dépit de ces réponses de l'hôte, I. scapularis peut nourrir pendant plusieurs jours en raison salive de la tique contient des protéines qui sont immunomodulateur, des agents lytiques, les anticoagulants, et fibrinolysins pour aider la tique nourrir 3,11,20,21,23. Les activités immunomodulatrices possédés par la salive de tique ou extrait des glandes salivaires (SGE) de faciliter la transmission, la prolifération et la diffusion de nombreux agents pathogènes transmis par les tiques 3,20,24-27. Pour mieux comprendre comment tiques agents infectieux provoquer une maladie, il est essentiel de disséquer les tiques se nourrissent activement et de recueillir la salive des tiques. Ce protocole vidéo montre les techniques de dissection pourla collection de l 'hémolymphe et la suppression des glandes salivaires de nourrir activement I. nymphes scapularis après 48 et 72 heures le placement de la souris après. Nous démontrons également le prélèvement de salive d'un adulte femelle I. tique scapularis.

Protocole

1. Collecte hémolymphe de préparation des lames

(Film 1)

  1. Retirez délicatement activement tiques d'alimentation d'un animal et le lieu dans le peroxyde d'hydrogène à 3% topique pour 5 minutes, puis dans l'éthanol à 70% pendant 10 minutes à la surface de stériliser.
  2. Avec un stylo pap dessiner un cercle sur une lame de microscope enduite de silane et de placer la tique dans le cercle stylo pap.
    1. Silane lames enduites sont utilisés pour une meilleure adhésion de l'hémolymphe de la lame de microscope.
  3. Voir la tique sous une loupe binoculaire (1X objectif, oculaire 10x, un grossissement de 3.5X).
  4. Poussez doucement sur le dos de la tique avec une pince à s'évaser jambes de la tique et d'immobiliser la tique.

Remarque: Lorsque l'immobilisation de la tique ne pas appuyer trop fort car cela peut perturber l'intestin moyen ou de percer la tique et de contaminer l'hémolymphe.

  1. Amputer la jambe de la tique ou les jambes à econjointe e distale avec une pointe fine scalpel jetable. Pour déterminer l'infectiosité par l'intermédiaire d'hémolymphe seulement 1 jambe doit être amputée. Pour la collecte d'hémolymphe sur une lame de plusieurs segments peuvent être amputé.

Remarque: Ne pas couper la jambe trop près du corps, car cela peut provoquer une contamination intestin moyen de l'hémolymphe.

  1. Après la ou les jambes sont coupées continuer à appliquer doucement la pression à dos de la tique pour l'hémolymphe de sécréter sur les jambes sur la diapositive. Déplacez doucement la tique autour de la diapositive pour répandre l'hémolymphe.

2. Ablation des glandes salivaires

(Films 2 & 3)

  1. Spot plusieurs piscines de 25 ul de tampon phosphate salin (PBS) sur une lame de microscope et placer une coche dans une des piscines de CPE.
  2. Voir la tique sous une loupe binoculaire (1X objectif, oculaire 10x, un grossissement de 3.5X).
  3. Stabiliser la tique avec pince à pointe amendes par la tenue du capitule base (pièces buccales) ou à l'arrière de la tique.
  4. Insérez les pinces fines pointes à l'arrière de la tique et découper la tique est dos pour exposer les organes. Si vous le souhaitez l'intestin moyen peut être retiré à ce moment et transféré à un pool de frais de PBS sur une lame de microscope ou à un microtube contenant du PBS.
  5. Trouver la paire de glandes salivaires (raisin, comme les grappes) situés bilatéralement aux côtés des jambes de la tique. Si les glandes salivaires ne sont pas visibles parmi les débris tique déplacer la partie principale tique, contenant encore des glandes salivaires, d'une piscine fraîche de PBS pour réduire la perturbation et la perte des glandes salivaires.

Remarque: Plus tôt dans la tétée, les glandes salivaires sont plus difficiles à localiser, car ils ne sont pas aussi développé que par rapport à plus tard dans l'alimentation.

  1. Retirer les glandes salivaires de la tique avec une pince fine pointe et les placer dans une piscine fraîche de PBS.
  2. Wie à pointe fine pince transférer les glandes salivaires à l'autre propre 25 PBS piscine pl, répétez cette étape de lavage 3-4 fois plus pour éliminer les micro-organismes externes et les débris tique.

Remarque: Lavez les grappes des glandes salivaires en douceur afin de réduire la perte et la perturbation des glandes salivaires individuelles.

  1. Placez les glandes dans une piscine propre de PBS sur une lame de silane enduit ou dans un microtube contenant du PBS.

3. Le prélèvement de salive

(Film 4)

  1. Retirez délicatement les tiques femelles adultes du lapin ou autre hôte à l'aide de fines pinces à bout juste avant qu'ils ne déposeront complètement gorgées de sang, des journées d'environ 5-7 après fixation.
  2. Respecter la tique près engorgée sur une extrémité d'une lame de microscope avec du scotch. Le ruban doit être placé à environ ¾ de la hauteur dos de la tique vers la tête, laissant capitule base de la tique (pièces buccales) exposés.
  3. Lorsque la bande se réunit le bord antérieur de la surface dorsale des tiques pipette 5 pi d'une solution de pilocarpine 5% (dans le méthanol). Permettre à la bande pour absorber la pilocarpine sur le dos du cocher, sans permettre à la pilocarpine à venir en contact avec capitule base de la tique.
  4. Monter un morceau de pâte à modeler non toxique sur la lame de microscope d'environ un pouce de pièces buccales de la tique.
  5. Utilisation de fines pinces à bout rompre la pointe d'un tube capillaire tiré 28 au diamètre souhaité.
  6. Voir capitule base de la tique sous une loupe binoculaire.
  7. Doucement s'adapter hypostome de la tique dans le tube capillaire permettant tiré les palpes maxillaires de résider à l'extérieur du tube capillaire.
  8. Appuyer sur l'extrémité opposée du tube capillaire dans la pâte à modeler pour maintenir le tube capillaire en place.
  9. Placez la tique monté saliver l'intérieur d'une chambre noire avec une humidité élevée (par exemple, une boîte à couvercle en polystyrène bordée de pap humide serviettes er). Incliner la lame de sorte que les points de hypostome au fond du récipient, permettant gravité à l'aide de prélèvement de salive.
  10. Placez le récipient à la température ambiante.
  11. Surveiller de près les tiques saliver pour la première heure, et de recueillir la salive comme il est généré par l'expulsion hors des tubes capillaires avec un bulbe de pipette Pasteur. Après la première heure, vérifiez l'accumulation toutes les heures pendant au moins 4 heures. Continuer à collecter la salive car il est généré.

Remarque: l'acquisition salive peut être arrêté une fois assez de salive sont recueillis pour l'étude en cours d'exécution.

  1. Si les tiques ne sont pas saliver ou si plus de salive est nécessaire, la salivation peut parfois être induite en utilisant le tube capillaire pour masser le hypostome.
  2. Ajouter 0,1 volumes de cocktail inhibiteur de la protéase à la salive et les conserver à -80 ° C jusqu'à ce que nécessaire.

4. Les résultats représentatifs

e_content "Film> 1 montre comment tenir une nymphe I. scapularis et partiellement alimenté amputer les jambes pour recueillir hémolymphe sur une lame de microscope. Une fois la ou les jambes sont amputées un liquide clair est sécrétée (figure 1A et 1B). Si l'intestin moyen est rompu l'hémolymphe est trouble car il est sort de la jambe amputée (s) (figure 1C et 1D).

L'extraction des glandes salivaires après la nymphe a nourri pendant 48 ou 72 heures est démontrée dans les films 2 et 3. Après la tique est percé il ya généralement une grande quantité de débris (composé de la trachée, tubes de Malpighi, du sang, du tissu conjonctif, etc), pour empêcher la perte ou la perturbation des glandes salivaires de la tique se déplacer à un pool de frais de PBS. Les chiffres 2A et 2B montrent où les glandes salivaires sont situées après la nymphe a été coupée et la figure 2C montre enlevé grappes des glandes salivaires dans une mare de PBS.

Le prélèvement de salive mis en place à partir de I. scapularis femelles adultes i s montré dans le film 4 et la figure 3. Une coche saliver dans un tube capillaire est observé dans le film 5. Cette méthode de collecte de salive utilisée pour stimuler la salivation pilocarpine et peut produire plus de 20 ul de la salive par tique femelle adulte.

figure-protocol-1
Figure 1. Structures marquées d'une nymphe I. scapularis.

Film 1. Collection Ixodes scapularis hémolymphe. Cliquez ici pour regarder un film .

figure-protocol-2
Figure 2. Non contaminés (A & B) et contaminés (C & D) qui se dégage de la jambe hémolymphe de la nymphe.

Movie 2. L'extraction des glandes salivaires à partir d'un 48 heures nourris I. nymphe scapularis.pload/3894/3894movie2.avi "> Cliquez ici pour regarder un film.

L'extraction Movie 3. La glande salivaire d'un 72 heures nourris I. nymphe scapularis. Cliquez ici pour regarder un film .

figure-protocol-3
Figure 3. Ixodes scapularis glandes salivaires nymphe. (A & B) Des exemples de glandes salivaires dans un 72 heures nourris nymphe, avant l'extraction. (C) Suppression de cluster glande salivaire.

Le prélèvement de salive Movie 4. Mettre en place d'un adulte I. scapularis tique femelle. Cliquez ici pour regarder un film .

figure-protocol-4
Le prélèvement de salive Figure 4. De l'adulte I. scapularis femelles tIcks. (A & B) Cochez monté sur une glissière avec son hypostome à la fin tiré du tube capillaire avec la fin unpulled du tube capillaire détenu par la pâte à modeler. (C & D) chambre humidifiée contenant adultes saliver I. scapularis tiques femelles.

Film 5. Ixodes scapularis tique femelle saliver dans un tube capillaire. Cliquez ici pour regarder un film .

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Discussion

La collection de l 'hémolymphe tique, les glandes salivaires et la salive est important dans l'étude des tiques transmission d'agents pathogènes, la prévalence, la diffusion, la prolifération, et la persistance dans les deux la tique et l'hôte 6,11-13,20,23,29. Il ya plusieurs façons de disséquer une tique 30,31. Toutefois, lors de la collecte des glandes salivaires, il est essentiel de disséquer la tique proprement les glandes salivaires ne sont pas rompues ou perdu dans les restes...

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Déclarations de divulgation

Nous n'avons rien à communiquer.

Remerciements

Les auteurs tiennent à remercier la Division de Vector-Borne Direction générale des ressources animales maladies, en particulier Andrea Peterson, Lisa Massoudi, Verna O'Brien, et John Liddell pour leur entretien et de maintenance des souris et des lapins. Nous aimerions également remercier Amy Ullmann, Theresa Russell, et Barbara J. Johnson pour leurs contributions à l'égard de ce manuscrit. Enfin, nous tenons à remercier Alissa Eckert dans le bureau du directeur adjoint pour la communication à la CDC pour la réalisation des illustrations graphiques et Judy Lavelle pour diriger tous les aspects juridiques liés à la prise de vue de ce manuscrit.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Réactif Entreprise Numéro de catalogue
Le peroxyde d'hydrogène Pêcheur H312-500
L'éthanol Acros 61509-5000
PBS Bioproduits Boston BM-2205
Dumont fine pince (3C) Pêcheur NC9906085
Silane lames de microscope traitées Bioworld 42763007-1
Stylo Pap Bioworld 21750008-1
Super Frost, plus des lames de microscope Pêcheur 12-550-18
Pilocarpine Sigma P6503-5G
Cocktail d'inhibiteurs de protéase Sigma P2714
# 11 scalpel jetable Plume 2975 # 11
Pâte à modeler non toxique Fisher S17307
Les tubes capillaires Chase scientifiques verre, inc 40A502

Références

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