Purification et visualisation de lipopolysaccharide de bactéries à Gram négatif par Hot-phénol aqueux d'extraction

Résumé

Nous décrivons une méthode modifiée de chaud extraction aqueuse de phénol pour purifier le lipopolysaccharide (LPS) de bactéries Gram-négatives. Une fois extraite, les LPS peuvent ensuite être analysées par SDS-PAGE et visualisés par coloration directe ou immunoblot de l'Ouest.

Résumé

Lipopolysaccharide (LPS) est une composante majeure de bactéries Gram-négatives membranes externes bactériennes. Il est une molécule tripartite composé de lipide A, qui est incorporé dans la membrane externe, un noyau oligosaccharides et répéter O-antigène unités qui s'étendent vers l'extérieur depuis la surface de la cellule ^{1, 2.} LPS est une molécule immunodominant qui est important pour la virulence et la pathogenèse de nombreuses espèces bactériennes, y compris Pseudomonas aeruginosa, Salmonella et Escherichia coli ^3-5, et les différences dans la forme LPS composition de l'antigène O la base pour le sérotypage des souches. LPS est impliqué dans l'attachement à des cellules hôtes lors de l'initiation de l'infection et offre une protection contre médiée par le complément meurtre; souches qui n'ont pas LPS peuvent être atténuées pour la virulence ^6-8. Pour ces raisons, il est important de visualiser LPS, en particulier à partir d'isolats cliniques. LPS Visualisation profils de bandes et de la reconnaissance spécifique d'un parntibodies peuvent être des outils utiles pour identifier les lignées de contrainte et de caractériser différents mutants.

Dans ce rapport, nous décrivons une chaude aqueuse-phénol méthode pour l'isolement et la purification de LPS de bactéries Gram-négatives des cellules bactériennes. Ce protocole permet l'extraction de LPS l'écart des acides nucléiques et des protéines qui peuvent interférer avec la visualisation de LPS qui se produit avec plus courts, des méthodes d'extraction moins intensives ^9. LPS préparés de cette façon peuvent être séparés par le dodécylsulfate de sodium (SDS)-électrophorèse sur gel de polyacrylamide (PAGE) et directement teinté à l'aide de glucides / glycoprotéine taches ou les méthodes standard de coloration à l'argent. Beaucoup anti-sérums contiennent des anticorps au LPS que des réactions croisées avec les protéines de membrane externe ou des cibles antigéniques d'autres qui peuvent nuire à la réactivité observés à la suite de l'Ouest de la immunoblot SDS-PAGE-séparés lysats cellulaires bruts. Le traitement aux protéases de lysats cellulaires bruts seuls n'est pas toujours un moyen efficace d'éliminer cettede fond en utilisant tel ou autres méthodes de visualisation. En outre, le traitement protéase vaste dans une tentative de supprimer ce fond peut conduire à LPS de mauvaise qualité qui n'est pas bien résolus par l'une des méthodes ci-dessus. Pour ces raisons, nous croyons que le protocole suivant, adapté de Westpahl et Jann ^10, est idéal pour l'extraction de LPS.

Protocole

1. Préparation de bactéries pour l'extraction LPS

1. Démarrer une culture de nuit dans 5 ml de milieu Luria Broth (LB), complété avec des antibiotiques si nécessaire. Cultiver la culture pendant la nuit (12-18 heures) dans un incubateur agitateur à 37 ° C et 200 rpm.
2. Diluer la culture avec 1:10 LB et de prendre une DO ₆₀₀ de lecture dans un spectrophotomètre. Sur la base de la DO ₆₀₀ lecture, faire une suspension de 1,5 mL de vos bactéries à une DO ₆₀₀ de 0,5.
3. Pellet les bactéries dans une microcentrifugeuse à 10.600 x g pendant 10 minutes. Retirer et jeter le surnageant. Le culot peut être con....

Discussion

Nous avons décrit un procédé de purification LPS l'écart des autres composants cellulaires, y compris les acides nucléiques et des protéines. Cette méthode offre une haute qualité LPS qui peuvent être utilisés dans un certain nombre de méthodes de visualisation différentes, y compris la coloration des glucides gels SDS-PAGE, comme le montre la figure 1. Cette méthode peut être utilisée au sérotype LPS à partir d'une variété de souches, à l'aide spécifique anti-sérums, ou pour montrer la parenté entre les iso.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Nom du réactif	Entreprise	Numéro de catalogue
DNase I recombinante, sans RNase	Roche	04716728001
RNase A	Roche	10109169001
Protéinase K	Pêcheur	BP1700
Tris-phénol saturé	Pêcheur	BP1750-100
Ether diéthylique	Thomas scientifique	C313K31
Pro-Q Emerald 300 Kit Gel Teinté Lipopolysaccharide	Molecular Probes	P20495