Filtres de laine de verre ont été utilisés pour concentrer les virus d'origine hydrique par un certain nombre de groupes de recherche à travers le monde. Ici, nous montrons une approche simple pour la construction de filtres de laine de verre et de démontrer les filtres sont également efficaces dans la concentration d'origine hydrique, les bactéries pathogènes viraux et protozoaires.
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Article de méthode
Filtres laine de verre pour concentration des virus d'origine hydrique et agricole des agents pathogènes zoonotiques
Dans cet article
Résumé
Résumé
La première étape clé dans l'évaluation des niveaux d'agents pathogènes dans l'eau contaminée présumée est la concentration. Les méthodes de concentration ont tendance à être spécifique à un groupe particulier pathogène, par exemple aux États-Unis de l'environnement Méthode Agence de protection de 1623 pour Giardia et Cryptosporidium 1, ce qui signifie de multiples méthodes sont nécessaires si le programme d'échantillonnage vise plus d'un groupe pathogène. Un autre inconvénient des méthodes actuelles est l'équipement peut être compliqué et coûteux, par exemple la méthode VIRADEL avec la cartouche du filtre à 1MDS pour concentrer les virus 2. Dans cet article, nous décrivons comment construire des filtres de laine de verre pour la concentration des agents pathogènes d'origine hydrique. Après élution de filtre, le concentré se prête à une étape de concentration seconde, comme la centrifugation, suivie par la détection des pathogènes et le dénombrement par des méthodes culturales ou moléculaire. Les filtres ont plusieurs avantages. La construction est simple et les filtres peuvent être construits à unetaille ny pour satisfaire aux exigences spécifiques d'échantillonnage. Les pièces du filtre sont peu coûteux, permettant de recueillir un grand nombre d'échantillons, sans de graves répercussions sur le budget du projet. Grands volumes d'échantillons (100S à 1000 s L) peut être concentrée en fonction du taux de colmatage de turbidité de l'échantillon. Les filtres sont faciles à transporter et avec un équipement minimal, comme une pompe et d'un débitmètre, ils peuvent être mis en œuvre dans le domaine de l'échantillonnage de l'eau potable traitée, l'eau de surface, eaux souterraines, et le ruissellement agricole. Enfin, la filtration de la laine de verre est efficace pour concentrer une variété de types d'agents pathogènes de sorte qu'un procédé est nécessaire. Nous rapportons ici l'efficacité des filtres à base d'eau en concentrant l'entérovirus humain, S almonella enterica, Cryptosporidium parvum, et le virus de la grippe aviaire.
Protocole
1. Préparation de la laine de verre
- Avant et après avoir effectué chaque lot de filtres, la stérilisation de la zone de travail avec une solution javellisée à 10%.
- Mettez des gants et une blouse. Stériliser un seau à l'autoclave à 121 ° C et 15 psi pendant au moins 20 minutes. Placez la laine de verre dans le seau stérile.
- Saturer la laine de verre avec de l'eau par osmose inverse et laisser tremper pendant 15 minutes.
- Égoutter l'eau par osmose inverse dans le seau.
- Saturer la laine de verre avec 1 M de HCl et laissez tremper pendant 15 minutes.
- Égoutter le HCl 1 M dans le seau.
- Rincer la laine de verre avec de l'eau par osmose inverse.
- Mélanger soigneusement.
- Vérifiez le pH en utilisant du papier pH et répétez l'eau par osmose inverse de rinçage jusqu'à ce qu'un pH neutre est atteint.
- Décanter l'eau de rinçage.
- Saturer la laine de verre avec 1 M de NaOH et laisser tremper pendant 15 minutes.
- Égoutter le NaOH 1 M dans le seau.
- Répéter l'osmose inverse de rinçage jusqu'à ce qu'un pH neutre soit atteinte.
- Décanter l'eau de rinçage.
- Au lieu d'un seau, une rondelle de laine de verre peuvent être construits, ce qui est de conception similaire à un lave-verres de pipette (Figure 1).
- Couvrir la laine de verre complètement avec phosphate stérile (PBS) ajusté à pH 6,8.
- Utilisez la laine de verre préparée immédiatement ou conserver à 4 ° C. Il peut être stocké pendant jusqu'à deux semaines. Avant d'utiliser, assurez-vous que le pH est neutre car il va augmenter au fil du temps. Si le pH n'est pas neutre, re-rincer avec de phosphate stérile saline tamponnée (pH 6,8).
2. Montage du filtre de laine de verre
- Percer un trou 11/16 de pouce dans les capuchons de PVC et de fils de prise de sorte que les raccords mâles nylon adaptateur peut être vissées dans les bouchons. Cette étape est nécessaire seulement pour la première assemblée. Par la suite, les bouchons peuvent être utilisés pendant des années. Appliquez du Téflonruban adhésif pour les fils de nylon et raccords à vis pour les bouchons.
- Emballez le tuyau en PVC avec des petits morceaux de laine de verre. Utilisez un piston en métal, comme une soupape de moteur de voiture, d'emballer serré. Emballage ne nécessite pas une grande force. Pack assez serré pour que la laine de verre reste en place et les canaux ne font pas. Toutefois, ne placez pas si étroitement de l'eau ne peut s'écouler à travers le filtre. Lorsque emballés de manière appropriée, un débit de 4 à 5 litres par minute devrait pouvoir être atteint lorsque le filtre est attaché à des robinets d'eau avec des pressions comprises entre 40-60 psi. Pour la taille des tuyaux en PVC spécifiée par ce protocole, environ 85 grammes lavé et laine de verre rempli est utilisé par tuyau. Tare du tube vide en PVC sur un équilibre chargement par le haut et le bloc avec de la laine de verre lavé jusqu'à ce que la masse tuyau augmente de 85 grammes.
- Insérez maille de polypropylène dans les bouchons en PVC avec raccords mâles en nylon adaptateur.
- Appliquer du ruban de téflon pour les parties filetées du tuyau en PVC.
- Visser les capuchons en PVC à l'p PVCipe et l'étiquette d'une extrémité de filtre à l'afflux et l'autre extrémité l'écoulement. Ceci est important plus tard pour l'étape d'élution. Par quel bout est marqué d'entrée n'a pas d'importance.
- Poussez 60 ml de phosphate stérile saline tamponnée (pH = 6,8) dans le filtre à l'aide d'un cathéter basculé seringue. Excédent sortira extrémité opposée.
- Wrap se termine bien avec du Parafilm pour éviter toute fuite. Les filtres peuvent être stockées jusqu'à 30 jours à 4 ° C.
3. D'échantillonnage
- Stériliser tube utilisé pour l'échantillonnage par recirculation ou par immersion articles pendant 30 minutes dans 0,525% (ie, une solution à 10% d'eau de Javel standard) NaClO. Suivez ce en drainant la solution d'hypochlorite et de neutraliser avec du thiosulfate de sodium à 0,05%, en ajoutant 25 ml d'un stock anhydre solution à 2% de thiosulfate de sodium à un litre d'eau par osmose inverse.
- Pour l'échantillon d'eau avec un pH supérieur à 7,5, ajuster le pH à entre 6,5 et 7,0 avec HCl. La concentration de HCl peut varier de 0,25M à 1 M. Quatre litres HCl 0,5 M est généralement suffisant pour deux échantillons de 800 litres, selon le pH ambiant de l'eau et la capacité de mémoire tampon. Injecter HCl lors de l'échantillonnage à l'aide d'une pompe péristaltique ou Venturi (Figure 2). Ajuster la vitesse de la pompe ou l'ouverture à venturi pour obtenir le pH cible. Mesurer le pH à la sortie de conduit échantillon en utilisant un pH-mètre champ.
- Utilisez un préfiltre si les sabots de laine de verre filtre de l'eau avec une turbidité élevée. (Spécifications pour le préfiltre et son logement sont dans la ligne la liste des matériaux.) Parce que les agents pathogènes peuvent être attachés à des particules piégées par le préfiltre doit être élue avec le filtre de laine de verre (voir ci-dessous).
- Régler le débit à entre 2 et 4 litres par minute. Volumes d'échantillons typiques sont comprises entre 200 et 1.500 litres.
- Débrancher le filtre de laine de verre et le ranger dans un sac en plastique stérile à 4 ° C pendant jusqu'à 48 heures.
4. Élution
- Apposer le filtre de laine de verre à un anneautenir avec l'extrémité d'entrée d'échantillon pointant vers le bas dans une bouteille en polypropylène. Éluer opposé de la direction d'écoulement de l'échantillon.
- Pousser 80 ml d'extrait de boeuf stérile 3% en 0,05 M de glycine ayant un pH de 9,5 dans le filtre.
- Attendre 15 minutes.
- Pousser un autre ml de l'extrait de boeuf 80 stérile 3% en 0,05 M de glycine ayant un pH de 9,5 dans le filtre.
- Poussez l'air approfondie du filtre jusqu'à ce que la mousse sort de l'entrée du filtre.
- Ajuster le pH éluat à entre 7,0 et 7,5 avec HCl 1M.
- Éluat Conserver à 4 ° C pendant jusqu'à 24 heures ou à -20 ° C pendant de longues périodes de temps.
- Éluer le préfiltre si elle est utilisée. Dévissez la partie supérieure de la cartouche du logement et verser toute l'eau résiduelle à l'intérieur du boîtier tout en maintenant le préfiltre en place avec des mains gantées stériles.
- Retirez le préfiltre de la cartouche du logement et de le glisser dans un 15 "x 6" sac zip-lock.
- Verser 200 ml d'extrait de boeuf stérile 3% dans 0,05 M glycine avec un pH de 9,5 dans le sac, fermer hermétiquement avec la fermeture à glissière.
- Inverser le préfiltre sac à plusieurs reprises afin d'assurer la surface entière entre en contact avec l'extrait de boeuf.
- Attendez 15 minutes, à l'occasion d'inversion et de masser le préfiltre en sac.
- Ouvrez le zip-lock. Saisir le sac autour du préfiltre étroitement à retirer le plus d'extrait de boeuf autant que possible et tirer le préfiltre avec des mains gantées stériles,.
- Verser l'éluat extrait de boeuf dans une bouteille en polypropylène.
- Ajuster le pH éluat à entre 7,0 et 7,5 avec HCl 1M.
- Éluat Conserver à 4 ° C pendant jusqu'à 24 heures ou à -20 ° C pendant de longues périodes de temps. L'éluat préfiltre peut être analysé séparément pour les agents pathogènes ou combiné avec l'éluat filtre de laine de verre.
5. Les résultats représentatifs
| Des agents pathogènes | Niveau turbidité de l'eau (NTU) un | Montant ensemencée / L b, c, d | % De récupération ± 1 SD | Essais Nombre indépendants |
| Entérovirus-poliovirus Sabin III | 0.5 | 500 | 81% ± 11 | 7 |
| Entérovirus poliovirus Sabin III | 0.5 | 5000 | 67% ± 12 | 8 |
| Entérovirus-poliovirus Sabin III | 215 | 500 | 59% ± 32 | 7 |
| Entérovirus-poliovirus Sabin III | 215 | 5000 | 38% ± 22 | 6 |
| Entérovirus-poliovirus Sabin III | 447 | 500 | 56% ± 18 | 8 |
| Entérovirus-poliovirus Sabin III | 447 | 5000 | 63% ± 37 | 8 |
| Cryptosporidium parvum | 0.5 | 5 | 38% ± 14 | 7 |
| Cryptosporidium parvum | 0.5 | 50 | 53% ± 19 | 8 |
| Pleurerptosporidium parvum | 215 | 5 | 40% ± 16 | 7 |
| Cryptosporidium parvum | 215 | 50 | 30% ± 6 | 6 |
| Cryptosporidium parvum | 447 | 5 | 33% ± 13 | 8 |
| Cryptosporidium parvum | 447 | 50 | 28% ± 11 | 8 |
| Salmonella enterica | 0.5 | 5 | 29% ± 24 | 7 |
| Salmonella enterica | 0.5 | 500 | 56% ± 16 | 8 |
| Salmonella enterica | 215 | 5 | 32% ± 24 | 7 |
| Salmonella enterica | 215 | 500 | 34% ± 11 | 6 |
| Salmonella enterica | 447 | 5 | 34% ± 18 | 8 |
| Salmonella enterica | 447 | 500 | 31% ± 24 | 8 |
- Unité de turbidité néphélométrique
- Les entérovirus énumérés par qPCR que des copies génomiques / L
- C. parvum énumérés par immunofluorescence comme oocystes
- S. enterica énumérés par la culture comme formant des colonies-unités
Tableau 1. La concentration de la laine de verre avec des turbidités d'eau variables et des densités de pathogènes.
| Des agents pathogènes | Lieu d'échantillons d'eau | Montant ensemencée / L, un | Reco% très |
| Grippe aviaire H5N2 | Sundi lac, Anchorage arrondissement | 2500 | 42,9% |
| Grippe aviaire H5N2 | Minto Flats, Fairbanks North Star Borough | 2500 | 36,7% |
| Grippe aviaire H5N2 | Portage Valley, Anchorage arrondissement | 2500 | 7,8% |
| Grippe aviaire H5N2 | Potter Marsh, Anchorage arrondissement | 2500 | 41,5% |
| Grippe aviaire H5N2 | Willow Lake, au Yukon-Koyukuk arrondissement | 2500 | 15,5% |
- Mesuré par qPCR que des copies génomiques / L
Tableau 2. Concentration de laine de verre du virus de la grippe aviaire en utilisant l'eau provenant de cinq sites en Alaska.
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Figure 1. Schéma de la rondelle de laine de verre. Cela peut être utilisé à la place d'un seau, un gain de temps de rinçage. Le concept est semblable à une rondelle pipette en verre.
Figure 2. De filtration de laine de verre avec injection d'acide par une pompe péristaltique. Noter la "T" de connecteur lorsque le tuyau de pompe présente acide dans la ligne d'échantillonnage entre le robinet d'eau et d'un filtre en laine de verre. ajustement du pH n'est nécessaire que si l'eau prélevée a un pH> 7,5.
Filtres de laine de verre sont efficaces en concentrant les agents pathogènes de l'eau avec un large éventail de niveaux de turbidité et de la densité des agents pathogènes (tableau 1). Pour tester cette hypothèse, 20 litres d'eau du robinet déchlorée a été mélangé avec du limon du sol séché loam (0, 1,27, ou 2,75 g / L) pour atteindre le niveau désiré de la turbidité et ensuite ensemencé avec des agents pathogènes à des densités différentes. L'eaua été adoptée à travers un filtre de laine de verre, les agents pathogènes concentrés dans l'éluat ont été dénombrés, et cette valeur a été le numérateur dans le calcul de récupération pour cent. La quantité d'agents pathogènes dans l'eau ensemencés, qui est, le dénominateur du calcul de récupération pour cent, a été déterminée d'abord par l'ensemencement des agents pathogènes dans un éluat négatif, alors l'énumération des agents pathogènes. L'éluat négative a été préparé par le passage d'un échantillon de 20 litres non ensemencées à travers un filtre et d'élution. Quantifier les agents pathogènes ensemencées dans un éluat négative évite des différences de dénombrement des agents pathogènes qui pourraient résulter de différences matrice créée par le filtre de laine de verre. L'importance de cette étape lors de la quantification des agents pathogènes par PCR en temps réel est discuté dans Lambertini et al. 3. Un échantillon de 20 litres de contrôle négatif a été concentré par filtration de laine de verre afin de déterminer n'y avait pas présente natif agents pathogènes qui pourraient confondre le calcul de récupération pour cent. Un 10 um nominale des pores de taille pré-filtre wtel qu'il est utilisé lorsque le niveau de turbidité était ≥ 215 NTU.
Poliovirus a été quantifiée par PCR quantitative en temps réel en utilisant la concentration secondaire et procédures d'extraction des acides nucléiques et des amorces et la sonde décrite dans Lambertini et al. 3. Cryptosporidium parvum a été quantifiée dans le volume de l'échantillon concentré final (FCSV) créée par la procédure de concentration secondaire pour le poliovirus . Les oocystes ont été visualisés par immunofluorescence (MERIFLUOR Cryptosporidium et Giardia Kit de détection, Meridian Life Science, Inc, Cincinnati, OH). Salmonella enterica a été quantifiée dans le FCSV par placage sur une gélose XLD (Remel, Lenexa, KS) et le comptage des colonies de formage unités.
Filtres de laine de verre sont efficaces dans la concentration des virus de la grippe aviaire (tableau 2). Faible virus de la grippe aviaire pathogène (H5N2) a été ensemencée dans l'eau à plusieurs endroits en Alaska et dans la récupération pour cent calculé tel que décrit Above. La concentration secondaire et les procédures d'acides nucléiques ont été réalisées comme pour le poliovirus, le virus a été quantifiée par PCR en temps réel en utilisant les amorces et les sondes décrites dans Spackman et al 4.
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Discussion
Filtres de laine de verre ont été utilisés par plusieurs équipes de recherche de se concentrer 3,5,6 virus entériques humains à partir d'une variété de sources d'eau comme l'eau potable a terminé en 7, les eaux souterraines 8,9, 10 eaux de surface, eau de mer 11, des eaux usées 12, et ruissellement des terres agricoles 13. Nous rapportons ici les filtres sont également efficaces dans la concentration du virus de la grippe aviaire ainsi que les...
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Déclarations de divulgation
Pas de conflits d'intérêts déclarés.
Remerciements
Nous tenons à remercier William T. Eckert pour raconter la vidéo. Développement du protocole de laine de verre a fait partie de l'eau du Wisconsin et de première instance de la santé pour les risques entériques (WAHTER étude), financés par des États-Unis EPA Grant STAR R831630. Échantillons de l'Alaska ont été recueillis par A. Reeves, A. Ramey, et B. Meixell avec le soutien financier de l'USGS. Toute utilisation des noms commerciaux, le produit, ou le cabinet est à des fins descriptives seulement et n'implique pas l'approbation par le Gouvernement des États-Unis.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Nom de réactif ou d'un élément | Entreprise | Numéro de catalogue | |
| Acide chlorhydrique | Fisher Scientific | A144-500 | |
| L'hydroxyde de sodium | Fisher Scientific | BP359-212 | |
| Phosphate Buffered Saline Le chlorure de sodium Phosphate de potassium dibasique- Phosphate de potassium monobasique- | Fisher Scientific Fisher Scientific Fisher Scientific | BP358-212 BP363-500 BP362-500 | |
| L'hypochlorite de sodium à savoir, eau de Javel | Le Co. Clorox | ||
| Thiosulfate de sodium anhydre | Fisher Scientific | S 475-212 | |
| Extrait de bœuf, desséchée | Becton, Dickinson and Company | 211520 | |
| Glycine | Fisher Scientific | G46-500 | |
| La laine de verre sodocalcique huilé Ou R-11 d'isolation en fibre de verre sans revêtement | Isover ref = "http://www.jm.com" target = "_blank"> Johns Manville | Bourré 725 QN | |
| Polypropylène maille | Industrielle de compensation | xN4510 | |
| 2 "x4" Sch 80 mamelon tuyau en PVC fileté | Grainger | 6MW35 | |
| 2 "PVC SCH 40 bouchon | Grainger | 5WDW3 | |
| Homme de montage en nylon adaptateur (1/2 "x1 / 2") | Etats-Unis en plastique Corp | 62178 | |
| Les bouteilles d'échantillonnage pour éluat-1 litre | Fisher Scientific | 03-313-4F | |
| 60 ml seringue | "Http://www.fishersci.com" target = "_blank"> Fisher Scientific | NC9661991 | |
| bandes de pH | Whatman | 2614 991 | |
| Préfiltre, polypropylène, 10 pouces cartouche, 10 pm | McMaster-Carr | 4411K75 | |
| Préfiltre de logement | Cole-Parmer | S-29820-10 |
Références
- US Environmental Protection Agency. Method 1623: Cryptosporidium and Giardia in Water by Filtration/IMS/FA. EPA 815-R-05-002. , (2012).
- Cashdollar, J. L., Dahling, D. R. Evaluation of a method to re-use electropositive cartridge filters for concentrating viruses from tap and river water. J. Virol. Methods. 132, 13-17 (2006).
- Lambertini, E. Concentration of enteroviruses, adenoviruses, and noroviruses from drinking water by use of glass wool filters. Appl. Environ. Microbiol. 74, 2990-2996 (2008).
- Spackman, E. Development of a real-time reverse transcription PCR assay for Type A influenza virus and the avian H5 and H7 hemagglutinin subtypes. J. Clin. Microbiol. 40, 3256-3260 (2002).
- Environment Agency. Optimisation of a new method for detection of viruses in groundwater. Report No. NC/99/40. , Environment Agency, National Groundwater and Contaminated Land Centre. West Midlands, United Kingdom. (2000).
- Vilaginés, P., Sarrette, B., Husson, G., Vilaginés, R. Glass wool for virus concentration at ambient water pH level. Water Sci. Technol. 27, 299-306 (1993).
- Vivier, J. C., Ehlers, M. M., Grabow, W. O. Detection of enteroviruses in treated drinking water. Water Res. 38, 2699-2705 (2004).
- Powell, K. L. Enteric virus detection in groundwater using a glass wool trap. In: Groundwater: Past Achievements and Future Challenges. Sililo, O. , Balkema, Rotterdam. 813-816 (2000).
- Hunt, R. J., Borchardt, M. A., Richards, K. D., Spencer, S. K. Assessment of sewer source contamination of drinking water wells using tracers and human enteric viruses. Environ. Sci. Technol. 44, 7956-7963 (2010).
- van Heerden, J., Ehlers, M. M., Heim, A., Grabow, W. O. Prevalence, quantification and typing of adenoviruses detected in river and treated drinking water in South Africa. J. Appl. Microbiol. 99, 234-242 (2005).
- Vilaginés, P. Round robin investigation of glass wool method for poliovirus recovery from drinking water and sea water. Water Sci. Technol. 35, 445-449 (1997).
- Gantzer, C., Senouci, S., Maul, A., Levi, Y., Schwartzbrod, L. Enterovirus genomes in wastewater: concentration on glass wool and glass powder and detection by RT-PCR. J. Virol. Methods. 65, 265-271 (1997).
- Pathogen losses in surface water runoff from dairy manure applied to corn fields. Borchardt, M. A., Jokela, W. E., Spencer, S. K. American Society for Microbiology General Meeting, New Orleans, LA, , (2011).
- Deboosere, N. Development and validation of a concentration method for the detection of influenza A viruses from large volumes of surface water. Appl. Environ. Microbiol. 77, 3802-3808 (2011).
- Lambertini, E. Virus contamination from operation and maintenance practices in small drinking water distribution systems. J. Water Health. 9, 799-812 (2011).
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Réimpressions et autorisations
