Dans cet article, un simple, quantitative, de dosage liquide phase de capture par affinité est présenté. C'est une technique fiable, basé sur l'interaction entre les billes magnétiques et les protéines marquées (par exemple nanocorps) d'une part et l'affinité entre la protéine marqué et une seconde, protéine marquée (poliovirus, par exemple) sur l'autre.
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Article de méthode
Un essai en phase liquide d'affinité de capture utilisant des billes magnétiques pour étudier interaction protéine-protéine: Le poliovirus Exemple-Nanobodies
Dans cet article
Résumé
Résumé
Dans cet article, un simple, quantitative, de dosage liquide phase de capture par affinité est présenté. Pourvu que d'une protéine peut être marqué et une autre protéine marquée, cette méthode peut être mis en œuvre pour l'enquête sur les interactions entre protéines. Il est basé sur une main sur la reconnaissance de la protéine marquée par des billes magnétiques revêtues de cobalt et d'autre part sur l'interaction entre la protéine marqué et une seconde protéine spécifique qui est marquée. Tout d'abord, les protéines marquées et étiquetées sont mélangés et incubés à température ambiante. Les billes magnétiques, qui reconnaissent la balise, sont ajoutées et la fraction liée de la protéine marquée est séparée de la fraction non liée en utilisant des aimants. La quantité de protéine marqué qui est capturée peut être déterminée de manière indirecte par mesure du signal de la protéine marquée est resté dans la fraction non liée. Le dosage de liquide décrit la phase d'affinité est extrêmement utile lorsque les protéines de conversion de conformation sont sensibles culAyed. Le développement et l'application de l'essai est démontrée pour l'interaction entre les poliovirus et du poliovirus en reconnaissant nanocorps 1. Depuis poliovirus est sensible à la conversion conformationnelle 2 lorsqu'il est attaché à une surface solide (résultats non publiés), l'utilisation de la méthode ELISA est limitée et d'un système en phase liquide à base doit donc être préféré. Un exemple d'un système en phase liquide à base souvent utilisé dans les polioresearch 3,4 est la protéine micro-immunoprécipitation Un test de 5. Même si ce test a prouvé son applicabilité, il faut un Fc-structure, qui est absente dans les nanocorps 6,7. Toutefois, comme une autre occasion, ces intéressants et stables anticorps à domaine unique 8 peut être facilement conçu avec des étiquettes différentes. Le couramment utilisé (His) 6-étiquette indique l'affinité pour les ions bivalents tels que le nickel ou le cobalt, qui à leur tour peuvent être facilement appliqué sur des billes magnétiques. Nous avons donc développé cette quantitative simpledosage de capture par affinité sur la base de cobalt revêtues billes magnétiques. Poliovirus a été marqué au 35 S pour permettre une interaction sans entrave avec les nanocorps et de faire une détection quantitative possible. La méthode est facile à réaliser et ne peut être établie avec un faible coût, qui est encore étayée par la possibilité de régénérer efficacement les billes magnétiques.
Protocole
Le principe (A) et un aperçu de la méthode (B) sont représentés dans la figure 1.
1. Préparation de la mémoire tampon
- Préparer Reliure / tampon de lavage en dissolvant le dihydrogénophosphate de sodium (50 mM) et de chlorure de sodium (300 mM) dans de l'eau et ajuster le pH à 8,0. En outre ajouter Tween 20 (0,01% (m / v) concentration finale), la méthionine (2% (m / v) concentration finale) et l'albumine (0,1% (m / v) concentration finale) et ajuster le volume requis.
2. Préparation des billes magnétiques
Préparer les billes magnétiques, selo....
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Discussion
Dans le protocole, la radioactivité de l'antigène interagissant avec le Nanobodies est définie comme la perte du virus radiomarqué à partir du surnageant. Par conséquent, la quantité de radioactivité précipitée (= 100 - en%) (lié à des billes magnétiques) peut être estimée de façon indirecte par la radioactivité dans le surnageant (= a%). D'autre part, il est également possible de mesurer la radioactivité de la fraction précipitée de l'antigène lié de manière directe par l'élution des immunocomplexes des.......
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Déclarations de divulgation
Nous n'avons rien à communiquer.
Remerciements
Les auteurs tiennent à remercier le personnel du département de la biotechnologie pharmaceutique et biologie moléculaire et en particulier Monique De Pelsmacker pour la préparation du virus radioactifs étiquetés. Nous sommes reconnaissants à Ellen Merckx et Hadewijch Halewyck pour leurs remarques et discussions intéressantes et de Gerrit De Bleeser pour son aide dans le laboratoire. Ce travail a été soutenu financièrement par une subvention de OZR la Vrije Universiteit Brussel (OZR1807), le Fonds voor Onderzoek Vlaanderen Wetenschappelijk (G.0168.10N) et l'Organisation mondiale de la Santé (TSA 200 410 791). Lise Schotte est un garçon prédoctoral de la Fonds voor....
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Nom du réactif Société Commentaires | |||
| Dynabeads His-Tag Isolement et Pulldown | Invitrogen | 101.03D | Les billes magnétiques |
| 'HiSafe' Optiphase 2 | Perkin Elmer | 1200 - 436 |
Références
- Thys, B., Schotte, L., Muyldermans, S., Wernery, U., Hassanzadeh-Ghassabeh, G., Rombaut, B. In vitro antiviral activity of single domain antibody fragments against poliovirus. Antiviral Res. 87, 257-264 (2010).
- Meloen, R. H., Briaire, J.
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Réimpressions et autorisations
