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Microscopie TIRF a émergé comme une technologie d'imagerie puissant pour étudier la dynamique spatio-temporelles de molécules fluorescentes in vitro et dans des cellules vivantes 1. Le phénomène optique de réflexion interne totale se produit lorsque la lumière passe à partir d'un milieu d'indice de réfraction élevé dans un milieu à indice de réfraction faible à un angle plus grand qu'un angle caractéristique critique (plus près d'être parallèle à la limite). Bien que toute la lumière est réfléchie dans de telles conditions, une onde évanescente est créée qui se propage à travers et le long de la frontière, ce qui diminue de façon exponentielle avec la distance, et ne pénètre que les zones d'échantillonnage qui sont près de 100-200 nm de l'interface 2. En plus de fournir supérieure résolution axiale, l'excitation réduit de sortir de fluorophores de discussion crée un signal très élevé des ratios de bruit et minimise les effets néfastes de photoblanchiment 2,3. Être une technique widefield, la FRBR permet également d'image plus rapide en courant alternatifquisition que la plupart des configurations basées sur la numérisation confocale.
À première vue, la faible profondeur de pénétration de la FRBR semble être incompatible avec l'imagerie de cellules bactériennes et fongiques, qui sont souvent entourés de parois cellulaires épaisses. Au contraire, nous avons constaté que les parois cellulaires des levures et des cellules bactériennes réellement améliorer la convivialité de la FRBR et d'accroître l'éventail des structures observables 4-8. De nombreux processus cellulaires peuvent donc être directement accessible par la FRBR dans de petits micro-organismes monocellulaires, qui offrent souvent de puissantes techniques de manipulation génétique. Cela nous permet d'effectuer des expériences in vivo biochimie, où la cinétique des interactions entre protéines et les activités peuvent être évaluées directement dans les cellules vivantes.
Nous décrivons ici les différentes étapes nécessaires à l'obtention des images de grande qualité pour TIRF Saccharomyces cerevisiae ou des cellules de Bacillus subtilis. Nous signaler des problèmes divers qui peuvent affect FRBR visualisation des sondes fluorescentes dans les cellules et d'illustrer la procédure avec plusieurs exemples d'applications. Enfin, nous démontrons comment les images TIRF peut encore être améliorée en utilisant des techniques de restauration d'image.