Article de méthode

Le α-test: Rapid portable sans énumération des CD4 utilisant la salive entier

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DOI :

10.3791/3999

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16 mai 2012

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1Department of Medicine, Weill Cornell Medical College , 2Department of Oral Biology, University of Missouri-Kansas City-School of Dentistry, 3Department of Pharmacology and Toxicology, University of Missouri Kansas City- School of Pharmacy, 4Regional Hospital, Bamenda, NWP, Cameroon, 5Mezam Polyclinic HIV/AIDS Treatment Center, Cameroon, 6Institute for Human Genetics and Biochemistry

Dans cet article

Résumé

Une méthode de numération des CD4, l'α-test, est décrite qui utilise la salive ensemble, de fournir rapides et précises des taux de CD4. Les sous-α essai coûts et élimine la nécessité d'une formation technique, des réactifs coûteux tels que les anticorps monoclonaux, l'instrumentation, de réfrigération, le transport des échantillons, ainsi que de collecte et de traitement du sang.

Résumé

Il est urgent de disposer d'une méthode abordable pour le dénombrement des CD4 afin de surveiller la maladie à VIH. Le dénombrement des CD4 est inaccessibles dans les régions à ressources limitées en raison des contraintes de temps et de température, du niveau technique requis et du coût des réactifs, en particulier des anticorps monoclonaux destinés à mesurer les CD4 sur les cellules sanguines, qui constituent actuellement la seule méthode acceptable. Une stratégie courante en laboratoire, permettant d'économiser du temps et de l'argent, consiste à calculer certaines valeurs sanguines plutôt que de les mesurer directement. Par exemple, les taux de LDL sont calculés à partir des taux mesurés de cholestérol total, de HDL et de triglycérides1. Ainsi, l'identification de corrélats libres (cell-free) qui régulent directement le nombre de lymphocytes T CD4+ pourrait fournir une méthode précise pour calculer les chiffres de CD4, en raison de la pertinence physiologique de ces corrélats.

Le nombre de cellules souches qui pénètrent dans le sang et sont destinées à devenir des lymphocytes T CD4+ circulants est déterminé par le chimioattractant CXCL12 et son récepteur CXCR4, en raison de leur influence sur la locomotion2. Le processus de locomotion des cellules souches vers le sang est également régulé par l'élastase leucocytaire humaine (HLECS) à la surface cellulaire et par l'inhibiteur actif de la protéinase α1 (α1PI, α1antitrypsine, SerpinA1) réactif à l'HLECS3. Dans la maladie à VIH-1, l'α1PI est inactivée en raison des processus pathologiques 4. Dans les stades précoces asymptomatiques de la maladie à VIH-1, l'α1PI active s'est révélée inférieure à la normale chez 100 % des patients VIH-1 non traités (médiane = 12 μM), puis atteint des niveaux normaux au cours des stades symptomatiques4, 5. Ce profil a été attribué à une inactivation immunitaire, et non à une synthèse insuffisante, à une inactivation protéolytique ou à un défaut d'oxygénation. Nous avons observé que chez les sujets infectés par le VIH-1 ayant >220 cellules CD4/μl, les chiffres de CD4 étaient corrélés aux concentrations sériques d'α1PI active (r2=0,93, p<0,0001, n=26) et d'α1PI inactive (r2=0,91, p<0,0001, n=26)5. L'administration d'α1PI à des sujets infectés ou non par le VIH-1 a entraîné des augmentations spectaculaires des chiffres de CD4, suggérant que l'α1PI participe à la régulation du nombre de lymphocytes T CD4+ dans le sang3.

Lorsqu'elle est stimulée, la salive totale contient un exsudat séreux suffisant (plasma contenant des substances protéiques qui traversent les parois des vaisseaux sanguins pour passer dans la salive) permettant la mesure de l'α1PI actif, et la corrélation de cette mesure constitue une preuve qu'il s'agit d'une méthode précise pour calculer les chiffres de CD4. Brièvement, des sialagogues tels que le chewing-gum ou l'acide citrique stimulent l'exsudation du sérum dans la salive buccale totale. Après stimulation de l'exsudation sérique, l'activité de l'α1PI sérique dans la salive est mesurée par sa capacité à inhiber l'activité de l'élastase. L'élastase pancréatique porcine (PPE) est une source facilement disponible et peu coûteuse d'élastase. La PPE se lie à l'α1PI en formant un complexe un-à-un qui empêche la PPE de cliver ses substrats spécifiques, dont l'un est le peptide colorimétrique succinyl-L-Ala-L-Ala-L-Ala-p-nitroanilide (SA3NA). L'incubation de la salive avec une concentration saturante de PPE pendant 10 minutes à température ambiante permet la liaison de la PPE à tout l'α1PI actif présent dans la salive. L'inhibition résultante de la PPE par l'α1PI actif peut être mesurée en ajoutant le substrat de la PPE, le SA3NA. (Figure 1). Bien que les chiffres de CD4 soient mesurés en fonction du volume sanguin (cellules CD4/μl), la concentration de l'α1PI dans la salive est liée à la concentration de sérum dans la salive, et non au volume de salive, car ce dernier peut varier considérablement au cours de la journée et d'une personne à l'autre6. Toutefois, pratiquement toutes les protéines présentes dans la salive proviennent du contenu sérique, et la teneur en protéines de la salive est mesurable7. Ainsi, l'α1PI actif dans la salive est calculé sous forme de rapport par rapport à la teneur en protéines salivaires et est appelé indice α1PI. Les résultats présentés ici démontrent que l'indice α1PI fournit une méthode physiologique précise et fiable pour calculer les chiffres de CD4.

Protocole

1. Préparer une solution fraîche Solutions de travail

  1. SCT: 0,05 M Tris Buffered Saline, pH 7,8 (TBS). Préparer 60 ml TBS / microplaque.
  2. EPI: l'élastase pancréatique porcine, de type 1 (PPE) est fourni sous forme de suspension. Bien agiter et diluer EPI SCT à environ 0,01 U / ml. Préparer 6 ml de solution de travail / microplaque).
  3. SA 3 NA: succinyl-L-Ala-L-Ala-L-Ala-p-nitroanilide (SA 3 NA). Préparer 0,1 M de stock SA solution 3 NA dans le diméthylsulfoxyde (DMSO) et utiliser immédiatement ou conserver à -20 ° C. Préparer la solution de travail 6ml / microplaque par dilution de stock SA solution 3 NA 1/100 dans du TBS.
  4. Bleu de Coomassie: Préparer une solution stock de 10% de bleu de Coomassie R-250 (Bleu de Coomassie) dans du TBS et utiliser immédiatement ou conserver à -20 ° C. Préparer 6 ml de solution de travail en diluant la solution stock de 1/1000 dans du TBS.

2. Préparer la salive

  1. Prélèvement de salive: En position debout, de stimuler l'exsudation du sérum dans la salive en plaçant un sialogogue tels que l'acide citrique ou de chewing-gum dans la bouche. Une goutte de citron sans sucre est commode pour les patients VIH-1, qui sont souvent édentés et incapable de mâcher de la gomme. Avalez le cas échéant pour la première fois 3 min, et de recueillir la salive de toute la bouche dans une tasse plafonné pour le prochain 3 min. Cela permettra d'environ 2 ml de salive. Utiliser immédiatement ou conserver à -80 ° C.
  2. MANIPULATION DE SALIVE: Si congelée spécimen dégel, à 37 ° C et le lieu sur la glace. Stockez spécimen frais ou décongelés à 2-4 ° C ne dépasse pas 3 jours. Avez salive pas de tourbillon, et d'éviter de pipetage mucine qui ne contient pas d'exsudat de sérum. Utilisez les précautions standard lors de la manipulation de salive http://www.cdc.gov/hicpac/pdf/isolation/Isolation2007.pdf .

3. Microplaques Set-up

  1. TAMPON: Les mesures sont effectuées en triple exemplaire. Pour chaque puits d'une plaque de microtitration est ajouté 130 pi SCT.
  2. SPECIMENS: Pour chaque puits de test, on ajoute 20 ul de salive pour un volume final de 150 pl / puits. Mélanger à la pipette sans introduire de bulles.
  3. COMMANDES: Le contrôle positif contient PPE, mais pas de la salive. Le contrôle négatif contient de la salive, mais pas PPE.To le contrôle positif est bien ajouté 20 uL du SCT. Pour le contrôle négatif est bien ajouté 20 uL de salive.
  4. INCUBATION EPI: Agiter la solution PPE fonctionne bien. Ajouter 50 uL solution de travail PPE à chaque puits à l'exclusion des puits témoins négatifs. Pour les puits de contrôle négatif, ajouter 50 ul du SCT. Incuber 10 min à 23 ° C.
  5. INCUBATION DU SUBSTRAT: Ajouter 50 uL SA solution 3 NA travaille à chaque puits. Incuber 45 min à 23 ° C.
  6. Bleu de Coomassie:. Ajouter 50 ul bleu de Coomassie solution de travail
  7. LECTURE: Lire l'absorbance dans un lecteur de microplaques, un 405 nm pour détecter SA 3 clivage NA qui représente activement α 1 PI et A 595 nm pour détecter au bleu de Coomassie qui représente la teneur en protéines.

4. Calculer α 1 Indice PI

  1. NORMALIZE LA MOYENNE A 405 nm et un nm 595: Pour chaque trois exemplaires, calculer la moyenne. Soustraire la moyenne du contrôle négatif de la moyenne des échantillons. Afin de minimiser la plaque à la plaque de variation, de normaliser les moyennes en divisant chaque moyenne des échantillons par la moyenne de contrôle positif comme suit:

figure-protocol-1

  1. CALCUL DE LA α 1 PI INEX: Diviser le normalisé A 405 nm par les normalisés A 595 nm:

figure-protocol-2

5. Les résultats représentatifs

Pour déterminer si l'α-test peut être adapté pour être utilisé comme un test de dépistage au point de soins pour surveiller la numération des CD4 dans les pays endémiques, des régions à ressources limitées, la salive stimulée a été recueillies auprès de 20 femmes et 11 hommes VIH-1 clinique des sujets traitant pour des soins de routine au Cameroun. Concorde avec les observations préliminaires au cours du développement de l'α-test à l'aide de salive recueillis à New York, le α 1 Indice PI dans la salive recueillie au Cameroun en corrélation avec le nombre de CD4 (r 2 = 0,91, p <0,0001. N = 31). La relation a été définie par une courbe sigmoïde 3-paramètre qui est compatible avec une relation dose-réponse (figure 2A). La confiance de 95% et des intervalles de prédiction sont représentées par des lignes bleues et rouges, respectivement (figure 2B).

Dansune étude précédente, nous avons déterminé que les cellules T CD4 présentent vélo sinusoïdale avec une périodicité de 23 ± 3,5 jours dans le VIH-1 sujets et chez les sujets atteints de la version héritée de α carence en 1 IP (PIZZ) 3. Présentée dans le présent est un exemple représentatif de l'ordinateur généré par analyse de la courbe sinusoïdale de CD4 vélo dans un non-VIH-1 présentant 27 témoins sains périodicité jour (figure 3A).

Générée par ordinateur d'analyse courbe sinusoïdale des cellules CD4 + changements de cellules T chez 6 sujets a donné des valeurs de crête à crête d'amplitude et de l'axe d'oscillation 3. Comme on pouvait s'y attendre, l'axe d'oscillation a été corrélée avec une amplitude (r 2 = 0,96, p = 0,009, n = 6) (figure 3B). Chez les patients seront CD4 bas T + nombre de cellules, les changements cycliques de la numération de lymphocytes T CD4 étaient de petite taille, et chez les patients atteints de CD4 + élevé de lymphocytes T, les changements cycliques étaient grandes.

Parce que ledroite de régression montre la figure 2 estime l'axe d'oscillation et de l'axe d'oscillation est corrélée avec une amplitude, l'amplitude peut être calculée pour la ligne de régression estimant ainsi dans quelle mesure ci-dessus et ci-dessous les CD4 + de la ligne de régression des cellules T on peut s'attendre à varier en raison de vélo (figure 3C). Superposer l'amplitude calculée à la figure 3C et l'intervalle de confiance calculé à la figure 2B, on a constaté que l'amplitude (ligne verte) se situe dans les 95% l'intervalle de confiance (ligne bleue) (figure 3D).

figure-protocol-3
Figure 1. Résumé de la procédure: l'acide citrique dans la bouche de la Place et de recueillir la salive. Ajouter la salive dilués dans les puits d'une microplaque en triple exemplaire. Ajouter EPI à chaque puits et incuber pendant 15 min à 23 ° C. Ajouter le substrat PPE à chaque puits et incuber pendant 45 min à 23 ° C. Ajouter au bleu de Coomassie et lire à 405 nm pour détecter l'activité de protection individuelle et à 595 nm pour détecter la protéine.

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Figure 2. Comparaison de l'α-test avec la méthode d'énumération CD4 standard. A) Le α-test a été réalisé par la quantification de la α 1 Indice PI dans la salive la bouche stimulé l'ensemble. La numération des CD4 ont été réalisées par un laboratoire médical indépendant utilisant la cytométrie de flux standard. Sang pour la cytométrie de flux et de salive ont été prélevés lors de la visite même clinique. La relation entre l'α 1 Indice PI et la numération des CD4 a été définie par une courbe sigmoïde à 3 paramètres (r 2 = 0,91, p <0,0001, n = 31). B) La confiance de 95% et des intervalles de prédiction sont représentées en bleu et rouge lignes, respectivement.

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Figure 3. Précision de calcul CD4 contants en utilisant le Index.A α1PI) cellules T CD4 + exposé vélo sinusoïdale avec 27 périodicité jour dans un contrôle non-VIH-1 en bonne santé. L'axe d'oscillation est représenté (pointillé rouge). B) Computer analyse généré onde sinusoïdale de CD4 des lymphocytes T du vélo a été utilisé pour calculer l'amplitude de crête à crête et de l'axe d'oscillation dans 4 sujets VIH-1, 1 non-VIH -1 Pizz sujet, et le non-VIH-1 de contrôle sain représenté dans la partie A. La relation entre T CD4 + amplitude cellule et axe d'oscillation a été définie par le 3-paramètre courbe sigmoïde (r 2 = 0,96, p = 0,009, n = 6). C) La relation sigmoïde entre l'amplitude et l'axe d'oscillation provenant en partie B) a été utilisée pour calculer l'amplitude attendue (lignes vertes) de points le long de la ligne de régression (ligne noire) de la figure 2. D) L'amplitude attendue intervalle (lignes vertes) était significativement différente de l'intervalle de confiance 95% (lignes bleues) comme déterminé par le test de Mann-Whitney somme des rangs (basée sur une comparaison de la différence moyenne entre l'intervalle de confiance de 95% et la ligne de régression (63 cellules / uL) et la différence moyenne entre la ligne de l'amplitude et la droite de régression (37 cellules / pl); p = 0,001).

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Discussion

Sérum non dilué contient médiane 36 uM α 1 PI et 3,6 uM α 2-macroglobuline (α 2 M) une différence de 10 fois 8. Les deux protéines compétition pour la liaison aux EPI. Ces deux caractéristiques, la concentration et l'affinité EPI, ont été exploitées pour développer une méthode qui est capable de mesurer précisément α 1 PI dans le sérum normal en présence de concurrence α 2 M 8. Cette méthode permet de détecter aussi peu que 50 μ nM 1

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Déclarations de divulgation

Pas de conflits d'intérêt déclarés.

Remerciements

La recherche a été soutenue par la Fondation de recherche Harry Winston.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Nom du réactif Entreprise Numéro de catalogue
Sialogogue, 0,05 M d'acide citrique Bonbons sans sucre eda, 4900, rue arrière N.20th, Philadelphia, PA 19144 Gouttes de citron sans sucre
Élastase pancréatique porcine, de type 1 (CE 3.4.21.36) Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63103 E1250
Succinyl-L-Ala-L-Ala-L-Ala-p-nitroanilide Sigma-Aldrich S4760
Bleu de Coomassie R-250 Sigma-Aldrich B7920
La culture de tissus traités, 96 microplaques ainsi Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ 07417-1886 35-3072
Lecteur de microplaques avec des filtres pour 405 nm et 595 nm MTX Systems Lab, 8456 Tyco Road, Building D, Vienna, Virginia 22182 Dynex P97277

Références

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Mots-clés

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