De base Caenorhabditis elegans Méthodes: Synchronisation et d'observation

Summary

La facilité de maintenir et de propager le nématode C. elegans Faire un organisme modèle agréable de travailler avec. La possibilité de synchronisation permet vers le travail avec une quantité importante de sujets au même stade de développement, ce qui facilite l'étude d'un processus particulier chez de nombreux animaux.

Abstract

La recherche sur la biologie moléculaire et du développement des nématode Caenorhabditis elegans a été commencé dans les années soixante-dix par Sydney Brenner et il a depuis été largement utilisé comme un organisme modèle ^1. C. elegans possède des attributs clés tels que la simplicité, la transparence et cycle de vie court qui en ont fait un système expérimental adéquat pour les études biologiques fondamentales pour de nombreuses années ^2. Découvertes dans ce nématode ont de larges implications car de nombreux processus cellulaires et moléculaires que le développement des animaux de contrôle sont évolutives ³ conservée.

Cycle de vie C. elegans passe par un stade embryonnaire et quatre stades larvaires avant que les animaux atteignent l'âge adulte. Le développement ne peut prendre de 2 à 4 jours selon la température. Dans chacune des étapes de plusieurs traits caractéristiques peuvent être observées. La connaissance de sa lignée cellulaire complète ^4,5 avec le annotat profondeion de son génome tourner ce nématode dans un grand modèle dans des domaines aussi divers que la neurobiologie ^6, le vieillissement ^7,8, biologie des cellules souches ⁹ et la biologie de la lignée germinale ^10.

Une fonctionnalité supplémentaire qui rend C. elegans un modèle intéressant à travailler avec la possibilité d'obtenir des populations de vers synchronisés à un stade précis grâce à un protocole relativement facile. La facilité de maintenir et de propager ce nématode a ajouté à la possibilité de synchronisation de fournir un outil puissant pour obtenir de grandes quantités de vers, qui peuvent être utilisés pour une grande variété de petites expériences ou à haut débit tels que des écrans ARNi, microarrays, séquençage massif, immunoblot ou hybridation in situ, entre autres.

En raison de sa transparence, C. structures elegans peuvent être distingués sous le microscope en utilisant la microscopie contraste interférentiel différentiel, aussi connu sous le nom micros Nomarskicopier. L'utilisation d'un liant l'ADN fluorescent, DAPI (4 ',6-diamidino-2-phénylindole), par exemple, peut conduire à l'identification spécifique et la localisation des cellules individuelles, ainsi que des structures subcellulaires et aux défauts qui leur sont associés.

Protocol

1. Protocole A: Worms de culture Blanchiment ¹¹

Les grandes populations de C. elegans peut être obtenu par culture soit dans des milieux liquides ou sur un milieu solide dans les plaques. Ils sont généralement cultivées sur des bases solides NGM (Media croissance nématodes) et nourris avec E. La bactérie E., qui est ajouté aux plaques soit vivants ou morts (tués par les UV ^12, par la chaleur ¹³ ou par le froid ^14). La procédure la plus courante utilise en direct OP50 E. coli, qui est défectueuse dans la synthèse de l'uracile et ne peut pas proliférer en une couche épaisse qui masquent des vers.

1. Mélanger 3 g de NaCl, 17 g d'agar-agar et 2,5 g de peptone et ajouter 975 ml d'H ₂ O. Autoclave pendant 50 min.
2. Refroidir le ballon à 55 ° C.
3. Ajouter 1 ml de 1 M CaCl _2, 1 ml de 5 mg / ml de cholestérol dans l'éthanol, 1 ml de 1 M MgSO ₄ et 25 ml de 1 M KPO _mémoire tampon de ₄ (chacun d'eux, mais le taux de cholestérol précédemment autoclavndlr).
4. Utilisation de procédures stériles distribuer la solution NGM dans des boîtes de Pétri; remplir plaques jusqu'à 2/3 de leur volume.
5. Une fois sec, il est conseillé de laisser les assiettes à la température ambiante pendant 2-3 jours avant de l'utiliser pour la détection de contaminants. Préparer une série de OP50 E. coli provenant d'un stock de glycérol (OP50 peut être obtenu à partir du Centre de Caenorhabditis génétique).
6. Choisissez une seule colonie et de la cultiver dans LB nuit à 37 ° C avec agitation.
7. Permettre à l'excès d'humidité de s'évaporer par les plaques en enlevant le couvercle dans l'écoulement laminaire et ajouter OP50 au centre des plaques avec une pipette Pasteur stérile.
8. Permettre à l'E. OP50 coli pelouse de croître pendant une nuit à température ambiante ou à 37 ° C pendant 8 heures.
9. Ajouter la quantité désirée de vers les plaques (si incubé à 37 ° C plaques doit être refroidi à la température ambiante avant l'utilisation).

CONSEILS:

• La coulée de la même quantité de supportsdans les plaques avec une pipette ou un flacon-pompe assure le même volume d'agar-agar dans les plaques et facilite le déplacement de la plaque sans qu'il soit nécessaire de recentrer le stéréomicroscope.
• Plaques (à la fois épépiné et ensemencés avec des bactéries) peuvent être utilisés plusieurs semaines après préparé lorsqu'il est stocké dans un récipient à la température ambiante ou à 4 ° C.
• Éviter les étalement des bactéries du bord de la plaque. Si la pelouse s'étend sur les bords de la plaque, les vers peuvent ramper sur les côtés, se dessèchent et meurent.
• Les vers vivent plus longtemps si les bactéries ensemencées sur des plaques sont déjà morts ^15.

2. Protocole B: Le traitement par solution d'hypochlorite alcaline ("blanchiment") ¹¹

La technique de blanchiment est utilisé pour synchroniser C cultures elegans au premier stade larvaire (L1). Le principe de la méthode réside dans le fait que les vers sont sensibles à l'eau de Javel pendant que la coquille d'oeuf protège embryos de lui. Après un traitement avec une solution d'hypochlorite alcaline, les embryons sont incubés dans des milieux liquides sans nourriture, ce qui permet l'éclosion, mais empêche le développement plus loin.

1. Laissez les vers de se développer jusqu'au stade adulte.
2. Récupérer les adultes gravides dans des tubes de 15 ml par lavage des plaques avec le tampon M9.
3. Vers culot par centrifugation pendant 2 minutes à 400xg (~ 1500 rpm dans une centrifugeuse de table standard) à la température ambiante et éliminer le surnageant.
4. Effectuer les lavages 1-3 jusqu'à ce que la mémoire tampon apparaît clairement des bactéries.
5. Ajouter la solution souhaitée blanchiment (tableau I) et agiter pendant quelques minutes (la destruction du tissu adulte doivent être surveillés en vertu de la loupe binoculaire et la réaction s'arrête lorsque des traces d'adultes sont encore visibles, ce qui prend généralement entre 3 et 9 minutes en fonction de plusieurs questions, telles que le volume du ver de granulés, mentionné dans la discussion) (Fig. 3).
6. Arrêter la réaction en ajoutant M9 buffer pour remplir le tube.
7. Rapidement centrifuger (puisque le traitement peut-être encore active) pendant 1 minute à 400 xg et éliminer le surnageant.
8. Laver granulés plus trois fois par remplissage du tube avec un tampon M9.
9. Ajouter 1 ml de tampon M9 au culot, ou de placer les œufs sur des plaques de NGM non ensemencés, et incuber à la température désirée avec une légère agitation. Une bonne aération doit être fourni (Fig. 4).

CONSEILS:

• Il existe différentes solutions de blanchiment, choisissez celui qui fonctionne mieux dans vos mains (Tableau 1, Fig. 1).
• Oeufs déjà prévues sur les plaques peuvent être récupérés par la mise au rebut de la surface de l'agar-agar avec un matériau souple comme un morceau d'un film X-ray.
• Reste trop nombreux d'animaux adultes peuvent nuire à la synchronisation car ils constituent une source de nourriture pour les larves récemment écloses.
• La hausse des températures légèrement accélérer le développement qui est gênant if toute ver saute de synchronisation parce que la différence de développement entre les vers synchronisés et non synchronisés sera plus grande à des températures élevées.
• Solution de blanchiment doit être effectuée juste avant son utilisation. En outre, l'eau de Javel perd la puissance après qu'il a été ouvert pendant un certain temps, en partie en raison de sa photosensibilité. Nous vous suggérons de partie aliquote de chaque bouteille nouveau dans des outres d'ambre petits pour empêcher cette perte et de minimiser l'exposition à la lumière.

3. Protocole C: Placage Worm

1. Attendre entre 12 et 24 heures (le temps de terminer le développement embryonnaire dépend de la température) après le blanchiment a été effectué et de récupérer les vers par centrifugation (2 minutes à 400 xg).
2. Rejeter le surnageant vers des semences, sur les plaques nécessaires et laissez le liquide restant sec.
3. Placez les plaques à la température requise.

CONSEILS:

• Les larves L1 dans M9 tampon peut être maintenue à 15 ° C à bascule au moins pendant une semaine wiThout altérations évidentes.
• soyez prudent lors du calcul des vers vous des graines parce que trop peut épuiser la nourriture plus vite que prévu et de ruiner votre expérience. Environ 500 L1 peuvent atteindre l'âge adulte dans une plaque de 55 mm, sans manquer de nourriture.

4. Protocole D: C. Observation elegans

D.1 Nomarski d'observation

Microscopie à contraste de différentiel d'interférence est une technique de microscopie optique d'illumination utilisés pour améliorer le contraste dans les échantillons transparents non colorées. Le mot se réfère à Nomarski le prisme utilisé, le nom de son inventeur. En observant les animaux vivants, nous sommes en mesure d'examiner la physiologie de l'animal avec les seules modifications provenant de l'immobilisation. En outre, comme aucun fixateur est ajouté, marqueurs fluorescents peuvent être observés in vivo. Ce fait et la possibilité de marqueurs fluorescents fusion à un gène d'intérêt qu'il soit possible de suivre les processus dans wHich la protéine de l'étude peuvent être impliqués. En utilisant la technique décrite dans ce protocole, non seulement vers vivants peuvent être observés, mais ils peuvent également être récupérés et étalés à nouveau.

Préparation pad Agar (juste avant l'utilisation):

1. Préparer agarose 2% dans de l'eau et faire fondre. Gardez fondu à 65 ° C.
2. Placer deux lames avec un morceau de ruban adhésif sur les deux côtés d'un troisième lame propre.
3. L'utilisation d'un lieu pipette Pasteur une goutte d'agar sur la surface propre.
4. Couvrez l'agar-agar avec un autre lame propre placé sur le dessus des trois lames perpendiculairement.
5. Presser doucement sorte que la chute de gélose est aplatie à l'épaisseur des entretoises de bande.
6. Une fois que la gélose se solidifie, tirez doucement sur les diapositives enregistrées et séparer les deux lames restantes en faisant glisser l'une par rapport à l'autre.

Montage des animaux vivants

7. Azide Déposer une goutte (10 pi) du lévamisole ou de sodium 1mM 10-30 mM sur til centre du pavé.
8. Transfert des animaux dans la goutte l'aide d'un pic ver.
9. Placez délicatement une lamelle sur les animaux et le fixer sur les deux côtés avec un certain vernis à ongles ou de silicone.

CONSEILS:

• Garder des aliquotes de 2% d'agarose à 4 ° C.
• Fondu agarose peut être maintenue à 65 ° C pendant au moins un jour.
• Remarque: Le lévamisole est un agoniste du récepteur nicotinique qui provoque une paralysie musculaire spastique ^16.
• Soyez prudent, l'azoture de sodium est extrêmement toxique!

D.2 fixation d'éthanol et de la coloration DAPI

Le protocole décrit ici représente un moyen rapide de la teinture des vers avec DAPI, cependant, en raison de l'dessèchement du ver certaines structures peuvent présenter une certaine altération. Il existe plusieurs autres méthodes pour fixer les vers précédents à la coloration DAPI tels que la fixation avec une solution de Carnoy ou le formaldéhyde qui préservent mieux l'intégrité du ver ¹⁷.

La fixation d'éthanol (modifié à partir de ¹⁸⁾

1. Lieu ~ 10 pl de tampon M9 (ou eau) sur une lame de microscope.
2. L'utilisation d'un ver de pioche transférer soigneusement 10-25 vers à la baisse.
3. L'utilisation de papier filtre ou d'un micro-pipette pour enlever un tampon autant que possible M9 sans enlever les vers ou les laisser sécher.
4. Ajouter ~ 10 pl d'éthanol à 90% et laisser sécher.
5. Répétez l'étape 4 une ou deux fois.

4 ',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) coloration

6. Mélanger DAPI avec les médias souhaités de montage à une concentration finale de 2 ng / ul.
7. Une fois que l'éthanol s'est complètement évaporé, ajouter 7 pl de la DAPI: montage mélange des médias.
8. Placez une lamelle et le fixer sur les deux côtés avec un certain vernis à ongles ou de silicone. Diapositives sera prêt pour l'observation d'environ 5 min après l'addition de DAPI.

CONSEILS:

• Le montage media contient du glycérol, de sorte qu'une petite quantité est suffisante pour couvrir toute la préparation.
• Il existe une grande variété de médias commerciaux de montage (Fluoromount ou de prolonger, par exemple), leur qualité et leur prix dépend de combien de temps vous souhaitez stocker votre échantillon.
• Soyez prudent, DAPI est un mutagène connu qui se lie fortement à AT régions riches en ADN.

Recettes

Milieu de croissance causée par le nématode (NGM)

1,7% (p / v) gélose
50 mM de NaCl
0,25% (p / v) peptone
1 mM CaCl ₂
5 ug / ml cholestérol
25 mM KPO ₄
1 mM MgSO ₄

M9 tampon

22mm KH ₂ PO ₄
42 mM de Na ₂ HPO ₄
86 mM de NaCl
1 mM MgSO ₄

Des solutions de blanchiment testé

	Recette n ° 1	Recette n ° 2	Recette n ° 3	Recette n ° 4	Recette n ° 5
l'eau (ml)	2,75	3.5	0.5	0.5	1.5
l'hydroxyde de sodium (ml)	1,25 (1M)	0,5 (5 millions)	2,5 (1M)	2,5 (2M)	2,5 (1M)
l'hypochlorite de sodium ~ de 4% (ml)	1	1	1	2	1
total (en ml)	5	5	4	5	5

Tableau I. Différentes recettes solution de blanchiment testé pour cet article. Recettes # 3 et # 4 sont de 2x, et devrait être ajouté sur le même volume de M9. Recettes pour # 1, # 2 et # 5 ont déjà été signalées ^{2, 11, 19.} Les concentrations finales: # 1 de NaOH 0,25 M, ~ de NaOCl 0,8% , N ° 2 NaOH 0,5 M, NaOCl ~ 0,8%, n ° 3 NaOH 0.625M, NaOCl ~ 1%, n ° 4 NaOH 1 M, NaOCl ~ 1,6%, n ° 5 NaOH 0,5 M, NaOCl ~ 0,8%.

5. Les résultats représentatifs

Figure 1. Comparaison de cinq différentes solutions de blanchiment à deux temps d'incubation différents. Vers N2 lavées deux fois avec M9 ont été divisés en cinq 15 ml tubes coniques contenant chacun une solution de blanchiment. Les tubes ont été secoués vigoureusement et 1 ml transférés dans un nouveau tube avec M9 pour arrêter la réaction après le délai spécifié. Après le blanchiment vers la procédure ont été incubées avec 1 ml de M9 à 20 ° C pendant 24 heures. Dans chaque cas, inférieure photo a été prise juste après le blanchiment, la photo ci-dessus 24 heures plus tard.

_upload/4019/4019fig2.jpg "alt =" Figure 2 "/>
Figure 2. Température de la solution de blanchiment affecte l'efficacité du traitement. Des volumes égaux de vers N2 ont été blanchies avec la même solution de blanchiment soit préalablement refroidie sur la glace pendant 20 minutes ou maintenue à 25 ° C pendant le même temps. Les deux colonnes sur les images montrent à gauche juste après le blanchiment. Après les vers de traitement ont été incubés dans 15 ml tubes coniques avec 1 ml de M9 à 20 ° C pendant 24 heures. Colonnes sur les images d'affichage à droite 24 heures plus tard.

Figure 3. Le ver rapport à granulés: le temps d'incubation d'hypochlorite alcaline affecte l'efficacité du traitement ul 50, 100, 250 et 500 du ver de granulés ont été incubées avec 2 ml de solution de blanchiment # 3 minutes 3, 6 et 9.. Hachurées L1, embryons morts et des restes de fragments adultes ont été quantifiés après incubation à 20 ° C pendant 2 4 heures dans 15 ml tubes coniques avec 1 ml de tampon M9. Environ trois confluentes 55 plaques mm avec des vers adultes sont nécessaires pour obtenir un 100 ver ul culot.

Figure 4. Une bonne aération est nécessaire pour l'éclosion et la survie de C. embryons elegans. Une pastille 100 pi de vers N2 ont été blanchies pendant 6 minutes et incubées dans 15 ml tubes coniques avec 1 ml, 5 ou 10, comme indiqué, de M9 à 20 ° C pendant 24 heures. La partie supérieure de la figure affiche les images des cultures après 24 heures, où les flèches indiquent les œufs qui n'ont pas éclos. Au fond, il est un graphique représentant la quantité de larves (gris clair) et d'embryons morts (gris foncé) 48 heures après le blanchiment aux conditions énoncées.

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Figure 5. Du cycle de vie de C. elegans. une. Durée approximative des vers à différents stades. Heures nécessaire pour atteindre chaque étape en fonction de la température (modifié à partir de ^20). B. Nomarski (haut) et DAPI (en bas) des photos de vers différents à des stades de développement indiqués. Caractéristiques les plus importantes dans chaque phase sont amplifiés L1: flèche indique les précurseurs de la gonade somatique et de la lignée germinale précoce L4: flèche noire (Nomarski) indique la vulve en développement; flèches blanches (DAPI) indiquent les deux bras à mi-gonadiques... la fin de L4: la flèche indique la vulve en développement au stade de la soi-disant arbre de Noël des jeunes adultes:. flèche noire indique un embryon dans l'utérus, les sagittaires points à la spermathèque, flèche blanche indique un ovocyte Gravid adultes:. Arrowhead (DAPI) souligne embryons fécondés. Flèche en DAPI image indique spermathèque.

Figure 6. La morphologie vulvaire en L3, L4 et adultes stades. Au stade L3 seulement une lumière petite où la vulve est formée peut être observée. A L4, cette lumière se développe formant le soi-disant "arbre de Noël". Chez l'adulte la vulve est déjà fermé. Les lignes jaunes indiquent l'emplacement de la vulve, à ces trois étapes.

Figure 7. Coloration DAPI à L3, L4 début, stades L4 et adultes. Au L3, de la lignée germinale est allongée. Au L4, gonades bras en forme de U présente la morphologie. Au stade tardif de sperme-L4 peuvent être observées dans la partie distale de la gonade. Les jeunes adultes présentent des ovocytes. La lignée germinale des adultes présente des ovocytes et des embryons. Les lignes jaunes délimitent lignées germinales à ee différentes étapes indiquées.

Figure 8. C. développement elegans à 15 et 25 ° C. vers N2 ont été blanchis, incubées pendant une nuit dans M9 et de l'agitation à 15 ° C, transférés à des plaques et cultivé les temps indiqués sur les températures indiquées.

Discussion

Synchronisation des nématodes

Plusieurs solutions de blanchiment ont été décrits. Nous avons essayé cinq recettes différentes (tableau I) et, dans nos mains, ils n'ont pas montré de différences significatives dans la synchronisation des populations de vers (Fig. 1). Cependant, nos expériences montrent que fait paramètres tels que la température (Fig. 2), la solution de blanchiment rapport: le volume de vers (Fig. 3) et le v...