De base Caenorhabditis elegans Méthodes: Synchronisation et d'observation

Summary

La facilité de maintenir et de propager le nématode C. elegans Faire un organisme modèle agréable de travailler avec. La possibilité de synchronisation permet vers le travail avec une quantité importante de sujets au même stade de développement, ce qui facilite l'étude d'un processus particulier chez de nombreux animaux.

Abstract

La recherche sur la biologie moléculaire et du développement des nématode Caenorhabditis elegans a été commencé dans les années soixante-dix par Sydney Brenner et il a depuis été largement utilisé comme un organisme modèle ^1. C. elegans possède des attributs clés tels que la simplicité, la transparence et cycle de vie court qui en ont fait un système expérimental adéquat pour les études biologiques fondamentales pour de nombreuses années ^2. Découvertes dans ce nématode ont de larges implications car de nombreux processus cellulaires et moléculaires que le développement des animaux de contrôle sont évolutives ³ conservée.

Cycle de vie C. elegans passe par un stade embryonnaire et quatre stades larvaires avant que les animaux atteignent l'âge adulte. Le développement ne peut prendre de 2 à 4 jours selon la température. Dans chacune des étapes de plusieurs traits caractéristiques peuvent être observées. La connaissance de sa lignée cellulaire complète ^4,5 avec le annotat profondeion de son génome tourner ce nématode dans un grand modèle dans des domaines aussi divers que la neurobiologie ^6, le vieillissement ^7,8, biologie des cellules souches ⁹ et la biologie de la lignée germinale ^10.

Une fonctionnalité supplémentaire qui rend C. elegans un modèle intéressant à travailler avec la possibilité d'obtenir des populations de vers synchronisés à un stade précis grâce à un protocole relativement facile. La facilité de maintenir et de propager ce nématode a ajouté à la possibilité de synchronisation de fournir un outil puissant pour obtenir de grandes quantités de vers, qui peuvent être utilisés pour une grande variété de petites expériences ou à haut débit tels que des écrans ARNi, microarrays, séquençage massif, immunoblot ou hybridation in situ, entre autres.

En raison de sa transparence, C. structures elegans peuvent être distingués sous le microscope en utilisant la microscopie contraste interférentiel différentiel, aussi connu sous le nom micros Nomarskicopier. L'utilisation d'un liant l'ADN fluorescent, DAPI (4 ',6-diamidino-2-phénylindole), par exemple, peut conduire à l'identification spécifique et la localisation des cellules individuelles, ainsi que des structures subcellulaires et aux défauts qui leur sont associés.

Protocol

1. Protocole A: Worms de culture Blanchiment ¹¹

Les grandes populations de C. elegans peut être obtenu par culture soit dans des milieux liquides ou sur un milieu solide dans les plaques. Ils sont généralement cultivées sur des bases solides NGM (Media croissance nématodes) et nourris avec E. La bactérie E., qui est ajouté aux plaques soit vivants ou morts (tués par les UV ^12, par la chaleur ¹³ ou par le froid ^14). La procédure la plus courante utilise en direct OP50 E. coli, qui est défectueuse dans la synthèse de l'uracile et ne peut pas proliférer en une couc....

Discussion

Synchronisation des nématodes

Plusieurs solutions de blanchiment ont été décrits. Nous avons essayé cinq recettes différentes (tableau I) et, dans nos mains, ils n'ont pas montré de différences significatives dans la synchronisation des populations de vers (Fig. 1). Cependant, nos expériences montrent que fait paramètres tels que la température (Fig. 2), la solution de blanchiment rapport: le volume de vers (Fig. 3) et le v.......