La cartographie des réseaux fonctionnels bactériens et voies de Escherichia Coli En utilisant des tableaux synthétiques génétiques

Summary

Systématiques et à grande échelle de synthèse génétiques écrans d'interaction gène-gène (ou épistasie) peut être utilisé pour explorer la redondance génétique et la voie de la diaphonie. Ici, nous décrivons un haut débit quantitatif synthétique de la technologie génétique de dépistage tableau, appelé ESGA que nous avons développé pour élucider les relations épistatiques et l'exploration des réseaux d'interactions génétiques Escherichia coli.

Abstract

Phénotypes sont déterminés par une série complexe de physique (par exemple protéine-protéine) et fonctionnelle (p. ex gène-gène ou génétique) des interactions (GI) ^1. Alors que les interactions physiques peuvent indiquer quelles protéines bactériennes sont associées sous forme de complexes, ils ne révèlent pas nécessairement la voie au niveau relationships1 fonctionnels. Écrans GI, dans lequel la croissance des doubles mutants porteurs de deux gènes délétés ou inactivés est mesurée et comparée aux simples mutants correspondants, peut éclairer les dépendances entre les loci épistatiques et donc de fournir un moyen pour interroger et découvrir de nouveaux liens fonctionnels ^2. Cartes à grande échelle GI ont été rapportés pour les organismes eucaryotes comme les levures ^3-7, mais les informations restent rares IG pour les procaryotes ^8, ce qui entrave l'annotation fonctionnelle des génomes bactériens. À cette fin, nous et d'autres avons développé à haut débit quantitatives bactériennes méthodes de dépistage GI ^{9, 10} Nous présentons ici les principales étapes requises pour effectuer quantitative E. coli synthétique procédure de dépistage génétique Array (ESGA) sur une échelle du génome ^9, en utilisant la conjugaison bactérienne naturelle et la recombinaison homologue pour générer et systémique pour évaluer la justesse d'un grand nombre de doubles mutants dans un format de tableau colonie. bref, un robot est utilisé pour transférer , grâce à la conjugaison, le chloramphénicol (Cm) - a marqué allèles mutants de Hfr ingénierie (haute fréquence de recombinaison) «souches donateurs dans un ensemble ordonné de kanamycine (Kan) - marqués F-bénéficiaires souches. Typiquement, nous utilisons la perte de fonction simples mutants portant des délétions de gènes non essentiels (par exemple, la collection «Keio ^'11) et des mutations de gènes essentiels hypomorphes (allèles conférant à savoir l'expression des protéines réduite, la stabilité ou l'activité ^{9, 12, 13)} interroger les associations fonctionnelles de gènes non essentiels et indispensables, respectivement. Après conjugaison et qui a suivi l'échange génétique induite par recombinaison homologue, les mutants résultants doubles sont sélectionnés sur milieu solide contenant deux antibiotiques. Après conséquence, les plaques sont numériquement imagée et la taille des colonies sont quantitativement classé par un système interne automatisé de traitement d'image ^14. Les IG sont révélés lorsque le taux de croissance d'un double mutant est soit significativement meilleure ou pire que ⁹ attendu. Aggravante (ou négative) des IG entraînent souvent entre la perte de fonction des mutations dans les gènes de paires de voies compensatoires qui empiètent sur ​​le même processus essentiel ^2. Ici, la perte d'un seul gène est tamponnée, de sorte que soit seul mutant est viable. Cependant, la perte des deux voies est délétère et les résultats de létalité synthétique ou de maladie (c.-à croissance lente). A l'inverse, apaisantes (ou positif) des interactions entre les gènes peuvent se produire dans la même voie ou de protéines complexes ² commedélétion de gène supporte seul est souvent suffisante pour perturber le fonctionnement normal de la voie ou complexes tels que des perturbations supplémentaires ne réduisent pas l'activité, et donc la croissance, en outre. Dans l'ensemble, l'identification systématique et l'analyse des réseaux IG peut fournir sans parti pris, des cartes mondiales des relations fonctionnelles entre un grand nombre de gènes, d'où la voie au niveau de l'information manquée par d'autres approches peuvent être inférées ^9.

Protocol

1. Construction de souches Hfr donatrices Cavalli Mutant par Recombineering ^{15, 16}

Les étapes de la construction des taches donateurs ESGA sont décrits ci-dessous. En bref, nous utilisons λ ciblée - Rouge médiation recombinaison homologue ¹⁶ de cassette d'ADN amplifié marqueur de sélection des fragments générés par PCR pour créer non essentiels mutants de délétion de gènes (section 1.1) ou de gènes essentiels hypomorphes souches mutantes donateurs (section 1.2), qui sont ensuite utilisés comme "requêtes" pour définir les réseaux gastro-intestinaux.

Remarque:....

Results

révèlent des relations fonctionnelles entre les gènes. De même, puisque les gènes d’une même voie présentent des modèles gastro-intestinaux similaires et que la similitude du profil gastro-intestinal représente la congruence des phénotypes, nous pouvons regrouper les gènes fonctionnellement apparentés en voies en regroupant leurs profils gastro-intestinaux. L’intégration de l’IG et des réseaux de corrélation IG avec des informations d’interaction physique ou d’autres données d’association, telles que les relation.......

Discussion

Nous avons établi un protocole étape par étape pour l'utilisation de robotique de dépistage ESGA pour enquêter sur les fonctions des gènes bactériens à un niveau voie en interrogeant GI. Cette approche peut être utilisée pour étudier les gènes individuels ainsi que les systèmes biologiques entières dans E. coli. Attentivement l'exécution des étapes expérimentales décrites ci-dessus, y compris tous les contrôles appropriés, et rigoureusement l'analyse et la validation des données indépendamment GI so.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
I. Antibiotiques
Chloramphenicol	Bioshop	#CLR201
Kanamycin		#KAN201
Ampicilline		# AMP201
2. Luria-Bertani medium
LB poudre	Bioshop	#LBL405
Agar	Bioshop	#AGR003
3. souches bactériennes et plasmides
souche Cavalli Hfr λ ; Système red (JL238)	Babu et al.14.
pKD3	E. coli Genetic Stock Centre, Yale
Keio E. coli F- collection du récipiendaire	National BioResource Project (NBRP) du Japon11
Hypomorphe E. coli F- souches SPA-tag	Biosystèmes ouverts ; Babu et al.14
4. Amorces
pKD3-base Amorces constantes dessalées			F1 : 5'-GGCTGACATGGGAATTAGC-3' R1 : 5'-AGATTGCAGCATTACACGTCTT-3'Amorces
désalées			sur mesure Cm-R : 5'-TTATACGCAAGGCGACAAGG-3' Cm-F : 5'- GATCTTCCGTCAGGTAGG-3'Amorces
sur mesure dessalées			F2 et R2 : régions constantes de 20 nt basées sur la séquence pKD3 et régions d’homologie personnalisées de 45 nt Région constante F2 : 5'-CATATGAATATCCTCCTTA-3' Région constante R2 : 5'-TGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3'S1 et S2 : régions constantes de 27 nt pour amorcer l’amplification de la cassette SPA-Cm et régions d’homologie personnalisées de 45 nt Région constante S1 : 5'AGCTGGAGGATCCATGGAAAAGAGAAG -3' S2 région constante : 5'- GGCCCCATATGAATCCTCCTTAGTT -3' KOCO-F et KOCO-C : amorces de 20 nt à 200 pb du site de délétion du gène non essentiel ou du site d’insertion du gène SPA-tag du gène essentiel
5. Réactifs de PCR et d’électrophorèse
Taq DNA polymérase	Fermentas	# EP0281
10X Tampon PCR	Fermentas	# EP0281
10 mM dNTPs	Fermentas	# EP0281
25 mM MgCl2	Fermentas	# EP0281
Agarose	Bioshop	# AGA002
Chargement colorant	NEB	#B7021S
Bromure d’éthidium	Bioshop	# ETB444
Tampon TBE 10X	Bioshop	# ETB444.10
Tris Base	Bioshop	# TRS001
Acide borique	Sigma	# T1503-1KG
0.5 M EDTA (pH 8.0)	Sigma	# B6768-500G
Échelle d’ADN	NEB	#N3232L
6. Kits d’isolement et de nettoyage de l’ADN
Kit d’isolement et de purification de l’ADN génomique	Promega	#A1120
Plasmid Midi	kit Qiagen	# 12143
QIAquick PCR	kit de purification Qiagen	#28104
7. Equipement pour PCR, Transformation et Replica-pinning
Thermocycleur	BioRad, iCycler
Électrophorèse sur gel d’agarose	BioRad
Électroporateur	Bio-Rad GenePulser II
Cuvette d’électroporation 0,2 cm	Bio-Rad
42 ° ; C agitateur à bain-marie	Innova 3100
Beckman Coulter TJ-25 centrifugeuse	Beckman Coulter
32 ° ; C shaker	New Brunswick Scientific, États-Unis
32 ° ; Incubateur à plaque C	Fisher Scientific
RoToR-HDA robot de paillasse	Singer Instruments
96, 384 et 1 536 coussinets à densité de broches	Singer Instruments
96 ou 384 longues broches	Singer Instruments
8. Équipements d’imagerie
Support de caméra	Kaiser
Appareil photo numérique, 10 mégapixels	Any Vendor
Caissons lumineux, unités Testrite 16 » x 24	Testrite
9. Coussinets ou plaques Recyclage
10 % Eau de Javel	N’importe quel fournisseur 70
d’éthanol N’importe
Hotte à flux	N’importe quel fournisseur
ultraviolette	N’importe quel Vendor
		10.
Tubes en polypropylène de 50 ml	Tout fournisseur
Tubes de micro-centrifugeuse de 1,5 ml	Tout fournisseur
de flacs coniques de 250 ml	VWR	# 29140-045
Tubes de culture stériles de 15 ml Thermo	Scientific	# 366052
Flacons cryogéniques	VWR	# 479-3221
Plaques rectangulaires	Singer Instruments
Plaques de microtitrage 96 puits et 384 puits	Singer Instruments	Nunc
Rouleau de plaque pour l’étanchéité	Sigma	#R1275
	ABgene	# AB-0580
Joints de plaque adhésive	Fisher Scientific	# 13-990-14-80
° ; C congélateur	Tout fournisseur