Identification des complexes protéiques dans Escherichia coli En utilisant séquentielle Purification par affinité peptide en combinaison avec la spectrométrie de masse en tandem

Summary

La purification par affinité des protéines marquées en combinaison avec la spectrométrie de masse (APMS) est une méthode puissante pour la cartographie systématique des réseaux d'interactions protéiques et d'enquêter sur le fondement mécaniste des processus biologiques. Ici, nous décrivons un peptide optimisé séquentielle d'affinité (SPA) procédure APMS développé pour la bactérie Escherichia coli Qui peut être utilisé pour isoler et caractériser stables complexes multi-protéiques jusqu'à homogénéité à partir de près de même faible nombre de copies par cellule.

Abstract

Comme la plupart des processus cellulaires sont médiés par des assemblages macromoléculaires, l'identification systématique des interactions protéine-protéine (PPI) et l'identification de la composition de sous-unité du complexe multi-protéique peut donner un aperçu de la fonction des gènes et améliorer la compréhension des systèmes biologiques ^{1, 2.} Interactions physiques peuvent être mis en correspondance avec confiance vialarge échelle haute isolation et la caractérisation des complexes de protéines endogènes dans des conditions proches des conditions physiologiques basés sur la purification par affinité des protéines chromosomiques marqués en combinaison avec la spectrométrie de masse (APMS). Cette approche a été appliquée avec succès dans les organismes évolutivement divers, y compris les levures, les mouches, les vers, les cellules de mammifères, et les bactéries ^1-6. En particulier, nous avons généré une affinité carboxy-terminale de peptides séquentielle (SPA) pour système de marquage double affinité de purification des complexes protéiques natifs de culture d'Escherichia coli à Gram négatif, en utilisant genetically-traitables souches de laboratoire d'accueil qui sont bien adaptés à l'échelle du génome des enquêtes sur la biologie fondamentale et les processus conservées des procaryotes ^{1, 2, 7.} Notre SPA-tagging système est analogue à la méthode de purification d'affinité en tandem développé à l'origine pour la levure ^{8, 9,} et se compose d'un peptide liant la calmoduline (CBP), suivi par le site de clivage pour la protéase du virus hautement spécifique du tabac etch (TEV) et trois copies du FLAG (FLAG 3X) épitope, ce qui permet deux cycles consécutifs d'enrichissement par affinité. Après amplification de cassette, spécifiques d'une séquence linéaire des produits de PCR codant pour la SPA-tag et un marqueur de sélection sont intégrés et sont exprimées en tant que cadre carboxy-terminaux dans un fond fusions DY330 qui est induite à exprimer de façon transitoire un système hétérologue est performant bactériophage lambda recombinaison ^10. Après deux étapes de purification utilisant la calmoduline et billes d'affinité anti-FLAG permet sélective hautementet une récupération efficace de même de faibles complexes protéiques d'abondance des cultures à grande échelle. Spectrométrie de masse tandem est ensuite utilisé pour identifier de façon stable les co-purification de protéines avec une sensibilité élevée (faibles limites de détection nanogramme).

Ici, nous décrivons détaillées étape par étape, les procédures communément utilisés pour le marquage des protéines systématique, la purification et la spectrométrie de masse basée sur l'analyse des complexes protéiques solubles de E. coli, qui peuvent être étendus et potentiellement adaptée à d'autres espèces bactériennes, y compris certains agents pathogènes opportunistes qui se prêtent à recombineering. Les interactions physiques qui en découlent peuvent souvent révéler intéressantes composants et des connexions inattendues suggérant de nouveaux liens mécanistes. Intégration des données PPI avec remplacement des données d'association moléculaire, tels que génétiques (gène-gène) les interactions et la génomique contexte (GC) des prédictions peuvent faciliter l'élucidation de l'organisation mondiale moléculaire de complexes multi-protéiques dans les deuxvoies méthodologiques. Les réseaux générés pour E. coli peuvent être utilisées pour mieux comprendre l'architecture fonctionnelle des produits des gènes orthologues dans d'autres microbes dont annotations fonctionnelles font actuellement défaut.

Protocol

1. Construction de gènes spécifiques SPA-tagging dans E. coli souche DY330

1. Le plasmide pJL148 englobant la séquence d'ADN SPA-tag et la kanamycine marqueur de résistance aux antibiotiques de cassette (Kan ^R) sont utilisés comme matrice dans une réaction en chaîne par polymérase (PCR) ^7. A 45 nt gène spécifique à l'amorce sens, située immédiatement en amont du codon stop du gène cible dans le cadre avec un 27 pb ('5'-AGCTGGAGGATCCATGGAAAAGAGAAG -3) amorce sens étiquette spécifique, et un 45 nt spécifique du gène amorce inverse, situé immédiatement en aval du codon stop du gène cible dans l'image avec un point d'ébullition 27 (5'-GGCCCCATATGAATATCCTCCTTAGTT -3 ') amorce anti-sens spécifique tag, sont utilisés pour amplifier le marqueur et SPA-Kan ^R cassette du pJL148 utilisant les conditions suivantes: 94 cycles de PCR ° C pendant 5 min; 30 cycles de 94 ° C pendant 1 min, 55 ° C pendant 1 min, 68 ° C pendant 2 min 10 sec, puis 68 ° C pendant 10 min. Ces séquences amplifiées servir uns substrats pour la ectopique introduit λ-Rouge machines de recombinaison homologue (voir ci-dessous).
2. Le produit de PCR est purifié en utilisant un kit QIAquick PCR purification pour éliminer les sels qui peuvent interférer avec l'électroporation. Le produit de PCR purifié est ensuite ciblé pour intégrer à l'extrémité 3 '(juste en amont du codon d'arrêt natif) d'un gène spécifique dans DY330 souche dans laquelle le mécanisme de recombinaison λ-rouge ¹⁰ est exprimé.
3. Le DY330 λ-Rouge souche exprimant est cultivée pendant une nuit dans 2 ml de Luria-Bertani (LB) à 32 ° C en agitant à 180 tours par minute. 1 ml de la culture d'une nuit est ensuite inoculée dans 70 ml de milieu LB frais dans 500 ml fiole conique. L'inoculum est cultivé à 32 ° C en agitant à 180 tours par minute jusqu'à ce que la DO ₆₀₀ atteigne environ 0,8.
4. La culture est transférée dans un nouveau erlenmeyer de 250 ml, où les cellules sont induites par incubation de la fiole dans un bain d'eau à 42 ° C en agitant doucement à180 tours par minute pendant 15 minutes. Immédiatement après l'induction, le ballon est mis en incubation dans un bain de bouillie de glace d'eau pendant au moins 30 min sous agitation.
5. La culture glacée est immédiatement transféré en pré-réfrigérés tube de 50 ml en polypropylène et soumis à une centrifugation à 3993 xg pendant 6 min à 4 ° C. Le culot cellulaire est remis en suspension dans 50 ml d'eau glacée stérile et centrifugé de nouveau à 3993 xg pendant 6 min à 4 ° C. Le culot cellulaire est alors remis en suspension dans 1 ml d'eau froide et transféré dans un tube de 1,5 ml Effendorf, et centrifugé à une vitesse maximale de 20 secondes à 4 ° C. Après deux ou trois étapes de lavage avec de l'eau glacée, le culot cellulaire est remis en suspension dans 700 ul enfin de l'eau glacée stérile, résultant en des cellules électro-compétentes.
6. Grâce à l'électroporation, une pi de l'amplicon purifié est introduit dans 40 pl de cellules électro-compétentes. Les cellules sont électroporation dans un Bio-Rad II GenePulser avec les paramètres suivants: 2,5 kV, 25 uF avec impulsionContrôleur de 200 Ω. Après recombinaison homologue et de l'intégration, les transformants qui ont réussi à recombiner l'étiquette / cassette dans le chromosome sont choisis en fonction de la résistance à Kan (figure 1A). Plusieurs transformants sont sélectionnés pour Western blot pour vérifier la génération correcte (c'est à dire un signal positif) de la SPA taggés protéines de fusion avec anticorps anti-FLAG M2 qui est sélective contre les épitopes drapeau de la SPA-tag.
7. Confirmé souche carboxy terminal de fusion SPA-tag est cultivé sur une grande échelle afin d'isoler des complexes de protéines solubles à partir des cellules récoltées en utilisant le protocole de purification SPA. Les grandes lignes des étapes de la procédure de purification par affinité tag est montré dans la figure 1B.

2. La culture et la sonication

1. Inoculer 100 pi d'une étiquette E. SPA- stock de glycérol coli dans 50 ml de bouillon terrible (TB) milieu liquide supplémenté avec 50 ul de 25 pg / ml of Kan solution dans une fiole conique de 250 ml. Cultiver la culture pendant la nuit à 32 ° C.
   Remarque: Comme la cassette λ inductible par la température dans la souche DY330 rouge est sous le contrôle d'un répresseur sensible à la température ^10, la souche de SPA-marqué E. coli est cultivée à 32 ° C.
2. Transférer 10 ml de la culture d'une nuit dans 990 ml tuberculose frais additionné de 25 pg / ml de Kan dans un ballon de 4 litres. La culture est développée à 32 ° C avec agitation constante à 250 tours par minute, pendant 5 à 6 heures, jusqu'à ce que la DO ₆₀₀ atteigne 2 à 3 ~.
3. Transférer le 1 litre E. coli SPA-tag culture pour nettoyer les bouteilles de centrifugation et tourner les cellules à 4 ° C dans Beckman J6-HC centrifugeuse @ 3993 xg pendant 15 min.
4. Le surnageant est éliminé des bouteilles de centrifugation. Reprendre le E. culots cellulaires coli avec 25 ml de tampon de sonication. Assurez-vous de garder les bouteilles de centrifugation sur la glace en tout temps.
5. Le culot remis en suspension esttransféré à tube de 50 ml en polypropylène Falcon et congelés à l'azote liquide. Les cellules congelées sont conservées à -80 ° C pour utilisation à long terme.
6. Avant de sonication, décongeler les cellules congelées complètement en gardant les boulettes sur la glace. Les échantillons décongelés sont transférés à une coupelle en acier inoxydable stérile placé sur de la glace pendant la sonication. La sonde est immergée dans l'échantillon et soumis aux ultrasons pendant 3 min. Encore 2 min, on laisse refroidir l'échantillon de surchauffe.
7. Le lysat cellulaire est traitée aux ultrasons transmis dans le tube de pré-réfrigéré centrifugation stérile, et on le soumet à une centrifugation à 4 ° C en utilisant une centrifugeuse Beckman JA-17 @ rotor 35.267 xg (16.000 rpm) pendant 15 min à deux reprises.
   Remarque: Dans le cas de la purification des protéines membranaires, le lysat cellulaire soniqué est centrifugé qu'une seule fois pendant 15 minutes parce que nous ne savons pas dans quelle fraction des protéines membranaires sont, c'est, que ce soit dans le culot ou dans la fraction surnageante. Donc, pour éviter la perte de plus de membresprotéines membranaires, nous tournons les cellules pendant 15 min à grande vitesse de centrifugation et le surnageant est ensuite traité pour la purification (voir les étapes ci-dessous), où 1% de détergent est utilisé pour solubiliser les protéines membranaires.
8. Le surnageant du tube de centrifugation est soigneusement transférée dans un tube Falcon de 50 ml en polypropylène et congelés à l'azote liquide. L'extrait de cellules congelées soniqué est stocké pour une période maximale de 6 mois à -80 ° C pour une utilisation ultérieure.

3. Purification par affinité

1. Avant d'utiliser, 100 pi de Anti-Flag M2 perles sont lavées par 10 volumes de tampon AFC (30 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 0,1% de détergent, et 0,1-0,5 mM PTCE [tris (2-carboxyéthyl) phosphine - l'acide chlorhydrique]) sans le détergent et l'agent de réduction TCEP (tris (2-carboxyéthyl) phosphine).
2. Le congelés, extrait cellulaire soniqué est décongelé en plaçant le tube dans l'eau froide. L'extrait cellulaire décongelée est incubé avec 3 pi de benzonase nucléase pendant 30 min à 4 ° C. A ce mélange, ajouter un détergent non ionique Triton X-100 (concentration finale du détergent devrait être de 0,1%) et 200 pi de suspensions anti-FLAG M2 billes d'agarose.
   Remarque: Pour toutes les purifications de protéines solubles, 0,1% de Triton X-100 est utilisé pour minimiser l'adsorption non spécifique, alors que pour la purification d'une protéine membranaire, différents doux détergents non ioniques, tels que C12E8 (octaéthylène dodécyl éther de glycol), DDM ( n-dodécyl β-D-maltoside) et le maltose-néopentylglycol (MNG) peut être utilisé à une concentration de 1% de détergent pour améliorer la solubilisation. Depuis différents détergents ont une efficacité variable solubilisation des protéines membranaires, il est recommandé d'effectuer des purifications de protéines indépendantes en utilisant plus d'un détergent.
3. Le contenu est mélangé doucement en tournant le tube pendant 3 heures à 4 ° C en utilisant un agitateur LabQuake. Après 3 h de rotation, le tube est centrifugé à 1.700 g pendant 6 minutes. Le surnageant est alors removed soin, autant que possible, sans perturber le cordon lâche granulés.
4. Le culot est remis en suspension dans le surnageant restant, puis transféré dans un 0,8 x 4 cm colonne de Bio-Rad polypropylène de préparation. S'assurer de retirer les bouchons de vidange par le bas de la colonne, afin de permettre les éluats à vidanger par gravité. Laver la colonne 5 fois avec étape de clivage TEV.
5. Après la vidange des éluats lavés, la sortie de fond de la colonne est fermée. À la même colonne, le clivage est réalisée par l'addition de 5 à 10 ~ pi (50 unités) de protéase TEV et 400 pl de tampon 1X AFC sur la colonne. S'assurer de fermer la partie supérieure de la colonne avec un capuchon. La colonne contenant les billes sont tournés doucement une nuit à 4 ° C pendant la nuit à l'aide d'un agitateur LabQuake.
6. Enlever le bouchon sur le dessus et le bouchon de sortie au bas de la colonne, et égoutter les éluats récupérés après clivage TEV dans une colonne contenant 200 suspensions frais ul de billes de sépharose-calmoduline qui est lavé par 10volumes de tampon de liaison calmoduline.
7. À la fois le haut et le bas de la colonne sont fixées hermétiquement, et le contenu de la colonne sont mélangées doucement par rotation pendant 3 heures à 4 ° C à l'aide d'un agitateur LabQuake.
8. Après 3 h de rotation, l'éluat est évacué en retirant le couvercle supérieur et le bouchon de fond de la colonne. La colonne est lavée quatre fois avec 200 pi de tampon de liaison 1X calmoduline suivie d'un lavage rigoureux avec 400 pl de tampon de lavage calmoduline.
9. La protéine liée est éluée en quatre fractions de 50 ul dans un nouveau tube Eppendorf en utilisant 1X tampon d'élution calmoduline. La fraction éluée est distribué dans deux tubes Eppendorf propres dans des volumes égaux. Les deux tubes sont ensuite séchés sous vide à l'aide d'une vitesse.
10. L'éluat séché d'un tube est utilisé pour l'exécution d'un gel coloration à l'argent, tandis que l'autre est stocké dans -80 ° C, avant d'utiliser la spectrométrie de masse.

4. Coloration à l'argent

1. Pour l'argent staining, la moitié du volume de SDS 3X (dodécyl sulfate de sodium) tampon d'échantillon est ajouté à 50 ul de l'éluat séché. Après avoir fait bouillir le mélange pendant 5 min, les échantillons sont chargés sur un gel de polyacrylamide SDS.
2. Après le gel a fini de s'exécuter, il est soigneusement placé dans une solution de fixation (méthanol à 50% et 10% d'acide acétique) et agité doucement sur un agitateur rotatif pendant 20 min. Le gel est ensuite rincé à l'éthanol à 20% pendant 10 min.
3. Le gel fixe est lavée deux fois à fond avec 500 ml d'eau bidistillée pendant 10 minutes pour assurer fond uniforme faible.
4. Le gel est ensuite agité doucement dans 500 ml de thiosulfate de sodium pendant 1 min, suivie de deux étapes de lavage avec de l'eau distillée pendant 20 sec.
5. L'eau est éliminée, et le gel est incubé dans 200 ml de nitrate d'argent 0,1% pendant 30 min. Après ce temps, le nitrate d'argent est éliminé et le gel est lavé avec de l'eau distillée pendant 20 secondes pour éliminer l'excès de nitrate d'argent.
6. Le gel est finalement la main agitée dans 75 mlde la solution de développement. Lorsque l'intensité désirée est atteinte, la solution de développement est éliminé et 80 ml d'acide acétique est ajouté pour arrêter la réaction. Assurer à incuber le gel dans l'acide acétique pendant une période minimale de 20 minutes pour une visualisation correcte des bandes de gel.

5. Protéolyse et préparation des échantillons pour la spectrométrie de masse

1. Pour l'échantillon séché, ajouter 50 ul du tampon de digestion et 0,9 ul de 100 mM PTCE-HCl (tris (2-carboxyéthyl) phosphine - acide chlorhydrique) et incuber le mélange pendant 45 min à température ambiante pour l'étape de réduction. Ensuite, 1 pl de 500 mM d'iodoacétamide est ajouté et incubé dans l'obscurité pendant 40 min un autre pour permettre d'alkylation échantillon.
2. Après le second tour de l'incubation, ajouter 1 ug de trypsine immobilisée sur le mélange et incuber soit à 37 ° C pendant 5 heures ou toute la nuit à température ambiante. Assurez-vous d'arrêter la réaction en ajoutant 1 ul d'acide acétique.
3. Pré-humide, la Millipore Zip-Tip pointe de la pipette en aspirant 10 ul de la solution de mouillage et d'équilibrage. Distribuer la solution à perdre. Par la suite aspirer 10 ul de la solution de lavage et distribuer la solution à perdre. Répétez cette étape deux fois.
4. Pour une fixation efficace du mélange peptidique à l'extrémité, d'une pipette mélanger le mélange de peptides de 20 fois. Le mélange de peptides qui ont adhéré à la pointe est lavé par aspiration et la distribution de la solution de lavage. Répétez cette procédure deux fois pour une fixation efficace du mélange de peptides à la pointe.
5. Avec le bout contenant le peptide lié, aspirer 10 ul de la solution de mouillage et d'équilibration, et distribuer dans un tube eppendorf propre. Répétez cette étape deux fois. Après séchage, les échantillons élués dans le vide de vitesse, les échantillons peuvent être analysés par spectrométrie de masse immédiatement ou conservés à -80 ° C avant utilisation.

6. Identification des protéines par LTQ Velos Orbitrap spectromètre de masse

Thcomposants électroniques polypeptidiques des complexes isolés sont identifiés à l'aide d'un Orbitrap LTQ Velos hybrides spectromètre de masse en tandem. L'exception des Orbitrap pouvoir de résolution (> 60.000 maximum intégral moitié de la largeur, ou FWHM) et la précision de masse (<2 ppm) qui minimise MS / MS échantillonnage de contaminants non pertinentes fond non spécifiques détectés dans purifications de commande, tandis que la vitesse élevée à piège à ions Velos composant peut détecter et peptides de fragments de faible abondance en utilisant à la fois le transfert d'électrons et de dissociation induite par collision modes de dissociation. Matchs de confiance élevé entre résultant spectres MS / MS sont mappés à la référence E. séquences de protéines coli en utilisant l'algorithme de recherche de base de données comme SEQUEST et chaque séquence correspondant évaluée au cours d'un algorithme de probabilité comme STATQUEST ^11. Le nombre total de spectres, l'unicité séquence peptidique et les contaminants de fond communs détectés dans le contrôle négatif (c.-à-maquette.) Purifications sont envisagées pour atteindre un bas empirique faux-distaux de découverte. Les étapes suivantes sont effectuées pour l'identification des protéines:

1. Les micro-colonnes sont emballées avec ~ 10 cm de 3 pm Luna-C ₁₈ et de résine sont en interface avec une source d'ions Proxeon nanoélectronébulisation qui est placé en ligne avec l'instrument Orbitrap.
2. Un Proxeon flux binaire nano HPLC pompe est utilisée pour délivrer un taux stable de flux pointe d'environ 300 ^-1 nl min pendant les séparations de peptides.
3. Pour parvenir à élution peptide, un gradient de tampon organique est mis en place selon la complexité de l'échantillon. Par exemple, le gradient suivant est généralement mis en place pour E. échantillons SPA coli: le solvant B est passée de 2% à 6% en 1 min, à 24% en 38 min, à 100% dans la prochaine 4 min, détenue à 100% pendant 1 min, puis a diminué à 2% en 1 min, et dernière maintenir à 2% pendant 15 min. Le solvant de phase mobile A a 95% HPLC gradient d'eau et 5% ACN avec de l'acide formique 0,1%, tandis que le solvant B a 5% HPLC gradient d'eau et 95% d'ACN avec 0,1% d'acide formique acid. Le débit à la pointe de l'aiguille est fixée à 300 nl min ^-1 pendant 60 min.
4. Comme les cycles de spectrométrie de masse de fonctionner grâce à un balayage complet de masse à 60.000 résolutions, 10 concomitants scans en tandem fragmentation de masse sont recueillies pour les ions précurseurs les plus intenses. L'exclusion dynamique, la sélection massale monoisotopique, et en temps réel des données dépendantes de caractéristiques de l'instrument d'acquisition sont activés.
5. Les spectres sont recherchés en utilisant un algorithme de recherche de base de données tels que SEQUEST contre une base de E. séquences de protéines coli, et le résultat est statistiquement filtré en utilisant un algorithme probabiliste comme STAQUEST ¹¹ pour assurer un taux faible de faux découverte. Seuls les candidats de confiance élevé (99% de probabilité) sont sélectionnés, tandis que les matchs montrant plus de 10 ppm en masse d'erreur par rapport à la masse des peptides théoriques sont éliminés sans autre considération.

Results

Une fois marquées les protéines d’appât, qui sont exprimées à des niveaux endogènes, sont purifiées par affinité à partir de cultures en phase logarithmique, les échantillons ont été analysés sur un gel de coloration à l’argent pour visualiser les composants polypeptidiques individuels des complexes stables isolés. Nous avons également soumis une deuxième partie des échantillons de protéines purifiées par affinité à la spectrométrie de masse en tandem sans gel (LCMS) afin d’identifier les séquences polypeptidiques corres...

Discussion

Un aspect essentiel de l'approche basée sur APMS SPA décrit ici est que le marquage est effectué dans le cadre naturel chromosomique, assurant ainsi la régulation des gènes normale est maintenue (. Promoteur natif appât préservé, où les niveaux d'expression n'est pas perturbé) et natif stable associée à complexes protéiques sont récupérés à court endogènes niveaux. Questions polarité opéron sont également évités par un promoteur comprenant orientée vers l'extérieur dans le marqueur de sélection....

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
I. Antibiotiques
Kanamycin	Bioshop	#KAN201
Ampicillin	Bioshop	#AMP201<
Bio-Tryptone	Bioshop	#TRP 402
Extrait de levure	Bioshop	#YEX 555
Glycérol	Bioshop	#GLY 002
K2HPO4	Bioshop	#PPM 302
KH2PO4Bioshop		#PPM 303
3. Souche bactérienne et plasmide
DY330		Yu et al. (2000)10
pJL148		Zeghouf et al. (2004)7
4. Réactifs de PCR et d’électrophorèse
Taq ADN polymérase	Fermentas	# EP0281
10 X tampon PCR	Fermentas	# EP0281
10 mM dNTPs	Fermentas	# EP0281
25 mM MgCl2	Fermentas	# EP0281
Agarose	Bioshop	# AGA002
Chargement colorant	NEB	#B7021S
Bromure d’éthidium	Bioshop	# ETB444
Tampon TBE 10X	Thermo Scientific	#28355
Tris Base	Bioshop	#TRS001
Acide borique	Bioshop	#BOR001
0,5 M EDTA (pH 8,0)	Sigma	# E6768
Échelle d’ADN	NEB	#N3232L
5. Kits d’isolement et de nettoyage des plasmides
Plasmid Midi	kit Qiagen	#12143
QIAquick PCR	kit Qiagen	#28104
6. Equipements de PCR et de Transformation
Thermocycleur	BioRad	iCycler
Électrophorèse sur gel d’agarose	BioRad
Électroporateur	Bio-Rad	GenePulser II
Cuvette d’électroporation 0,2 cm	Bio-Rad
42 ° ; C agitateur		Innova 3100
Beckman Coulter TJ-25 centrifugeuse	Beckman Coulter	TS-5.1-500
32 ° ; C Shaker	New Brunswick Scientific, États-Unis
32 ° ; C grand Shaker	New Brunswick Scientific, États-Unis
32 ° ; Incubateur à plaque C	Fisher Scientific
7. Électrophorèse et Western blot
Acrylamide monomère, N,N'- méthylènebis-acrylamide	Bio-Rad	#161-0125
Persulfate d’ammonium	Bioshop	# AMP001
n-butanol	Sigma	# B7906
TEMED	Bioshop	#TEM001
Papier filtre Whatman No. 1	Fischer Scientific	#09-806A
Mini protéiforme 3 cellules	Bio-Rad	#165-3301
Dispositif de transfert de gel iBlot	Invitrogen	#IB1001
Membranes de nitrocellulose	Bio-Rad	#162-0115
Anticorps monoclonal anti-drapeau M2	Sigma	#F3165
Raifort peroxydase	Amersham	#NA931V
Pré-coloré étalons de poids moléculaire des protéines	Bio-Rad	#161-0363
Réactif de chimiluminescence	PIERCE	#1856136
Film d’autoradiographie	Clonex Corp	#CLEC810
Papier buvard Quick Draw	Sigma	#P7796
Agitateur à bascule à plate-forme C2	New Brunswick Scientific, États-Unis
Sonicator	Branson Ultrasonic	#23395
NaCl	Bioshop	#SOD001
Inhibiteurs de protéase	Roche	#800-363-5887
0.5 mM TCEP-HCl	Thermo Scientific	#20490
9. Réactifs et équipement de purification d’affinité
0,8 x 4 cm Colonne en polypropylène Bio-Rad	Bio-Rad	#732-6008
Nucléase benzonase	Novagen	#70746
Perles d’agarose anti-FLAG M2	Sigma	#A2220
Perles de calmoduline-sépharose	GE Healthcare	#17-0529-01
TEV protéase	Invitrogen	#12575-015
Triton X-100	Sigma	#T9284
CaCl2	Sigma	#C2661
EGTA	Sigma	#E3889
LabQuake	Shaker Thermolyne	#59558
10. Réactifs de coloration à l’argent
Méthanol	Bioshop	#MET302
Acide acétique	Bioshop	t#ACE222
Sodium-thiosulfate	Sigma	#S-7143
Nitrate d’argent	Fischer Scientific	#S181-100
Formaldéhyde	Bioshop	#FOR201
Carbonate	de sodiumBioshop	#SOC512
11. Réactifs et équipements pour l’identification des protéines
Trypsin Gold, Spectrométrie de masse Grade	Promega	# V5280
50 mM NH4HCO3	Bioshop	#AMC555
1 mM CaCl2	Bioshop	#CCL302
Acetonitrile	Sigma	#A998-4
Formic acide	Sigma	#F0507
eau de qualité HPLC	Sigma	#95304
Iodoacétamide	Sigma	#16125
Millipore Zip-Tip	Millipore	# ZTC18M960
~10 cm de 3 &mu ; m Luna-C18 résine	Phenomenex
Proxeon nano Pompe HPLC	Thermo Fisher Scientific
LTQ Orbitrap Velos spectromètre		de masse Thermo Fisher Scientific
12. Matériel de laboratoire
Fioles coniques de 4 litres	VWR	#89000-372
50 ml Tubes de faucon en polypropylène	N’importe quel fournisseur
Tubes micro-centrifugeuses de 1,5 ml	Tout fournisseur
250 ml de flacons	coniques VWR	#29140-045
Tubes de culture stériles de 15 ml	Thermo Scientific	#366052
Flacons cryogéniques	VWR	#479-3221-80
° ; C congélateur	Fisher Scientific	#13-990-14
Système de vide rapide	Thermo Scientific
Tampons et solutions 1. 1 litre de bouillon Terrific (TB) média 11 g de Bio-Tryptone 22 g d’extrait de levure 2 % de glycérol 50 ml de bouillon de sel de potassium solution 2. Solution mère de sel de potassium 1,5 M K2HPO4 0,35 M KH2PO4 3. Tampon de sonication 20 mM Tris-HCl (pH 7,9) 150 mM NaCl 0,2 mM EDTA 10 % Glycérol Avant utilisation, ajouter un inhibiteur de protéase (PI) et 0,1-0,5 mM de TCEP 4. Tampon AFC 30 mM Tris-HCl (pH 7,9) 150 mM NaCl 0,1 % détergent Avant utilisation, ajouter PI et 0,1-0,5 mM TCEP 5. Tampon de clivage TEV 30 mM Tris-HCl (pH 7,9) 150 mM NaCl 0,2 mM EDTA 0,1 % détergent Avant utilisation, ajouter PI et 0,1-0,5 mM TCEP 6. Tampon de liaison à la calmoduline 30 mM Tris-HCl (pH 7,9) 150 mM NaCl 2 mM CaCl2 0,1 % détergent Avant utilisation, ajouter PI et 0,1-0,5 mM TCEP 7. Tampon de lavage à la calmoduline 30 mM Tris-HCl pH 7,9 150 mM NaCl 2 mM CaCl2 0,1-0,5 mM TCEP 8. Tampon d’élution de calmoduline 30 mM Tris-HCl (pH 7,9) 100 mM NaCl 10 mM EGTA 0,1-0,5 mM TCEP 9. Solution de développement (1L) 37 % Formaldéhyde 30 g de carbonate de sodium 1000 ml d’eau distillée 10. Tampon de digestion 50 mM NH4HCO3 1 mM CaCl2 11. Solution de mouillage et d’équilibration acétonitrile à 70 % (ACN) dans de l’acide formique à 0,1 % 12. Solution de lavage 100 % H2O dans de l’acide formique à 0,1 %