Les îlots de rongeurs évaluation de la réplication et la fonction des cellules bêta dans Adenovirally transduites isolées

Summary

Ce protocole permet d'identifier les facteurs qui modulent fonctionnelle masse des cellules bêta de trouver des cibles thérapeutiques potentielles pour le traitement du diabète. Le protocole consiste en une méthode simplifiée pour évaluer la réplication des îlots et la fonction des cellules bêta des îlots de Langerhans isolés de rat après la manipulation de l'expression des gènes par des adénovirus.

Abstract

L'homéostasie du glucose est principalement contrôlée par les hormones du système endocrinien de l'insuline et le glucagon, sécrété par la version bêta du pancréas et des cellules alpha, respectivement. Fonctionnelle masse des cellules bêta est déterminée par la masse des cellules bêta anatomique ainsi que la capacité des cellules bêta pour répondre à une charge en éléments nutritifs. Une perte de masse des cellules bêta fonctionnelles est au cœur de ces deux formes principales de diabète ^1-3. Considérant que les résultats en déclin bêta fonctionnelles de masse de cellules à partir d'une attaque auto-immune de type 1 du diabète, dans le diabète de type 2, cette décroissance se développe à la fois une incapacité des cellules bêta à sécréter de l'insuline de façon appropriée et la destruction des cellules bêta à partir d'un cadre de mécanismes. Ainsi, les efforts visant à restaurer la fonctionnalité de masse des cellules bêta sont primordiaux pour un meilleur traitement des cures et potentiels pour le diabète.

Des efforts sont en cours pour identifier les voies moléculaires qui peuvent être exploitées afin de stimuler la réplication et d'améliorer la fonction des cellules bêta.Idéalement, les objectifs thérapeutiques permettrait d'améliorer à la fois la croissance des cellules bêta et la fonction. Peut-être plus important, cependant, c'est de déterminer si une stratégie qui stimule la croissance des cellules bêta se fait au prix de la fonction des cellules bêta atteinte (par exemple avec certains oncogènes) et vice-versa.

Par systématiquement la suppression ou la surexpression de l'expression de gènes cibles dans les îlots isolés de rat, on peut identifier des cibles thérapeutiques potentielles pour augmenter la masse des cellules bêta fonctionnelles ^4-6. Des vecteurs adénoviraux peut être utilisé à des protéines efficacement surexpriment ou démontable en îlots isolés de rat ^4,7-15. Ici, nous présentons une méthode pour manipuler l'expression des gènes en utilisant transduction adénovirale et d'évaluer la réplication des îlots et la fonction des cellules bêta des îlots de Langerhans isolés de rat (figure 1). Cette méthode a été utilisée précédemment pour identifier de nouvelles cibles qui modulent la réplication des cellules bêta ou la fonction ^{5,6,8,9,16,17.}

Protocol

1. Transduction adénovirale et la culture d'îlots de rats

1. Préparer une plaque à 6 puits de culture tissulaire non revêtu par addition de 2 ml de milieu (RPMI 1640 contenant 8 mM de glucose, 10% de sérum bovin foetal, de 50 unités / ml de pénicilline, et 50 mg / ml de streptomycine) au nombre requis de puits. Par exemple, une expérience typique peut exiger trois puits - un de chaque pour un contrôle sans virus, un contrôle du virus (par exemple, GFP-exprimer adénovirus), et le groupe expérimental.
2. Chauffer la plaque à 37 ° C en le plaçant dans un incubateur de culture tissulaire pendant au moins 30 min.
3. Immédiatement après isolement des ....

Discussion

Établir des voies qui peuvent être modulés afin de stimuler la réplication et d'améliorer la fonction des cellules bêta sont pertinentes pour les deux principales formes de diabète. Parce que fonctionnelle masse des cellules bêta est tributaire de l'existence et la fonction de cellules sécrétrices d'insuline, l'évaluation de ces déterminants a simultanément ses avantages. Ce protocole décrit un protocole simplifié pour déterminer si la surexpression ou la suppression d'une protéine conduit à des chan.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nom du réactif	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
RPMI 1640 les médias	Gibco	11879
Pénicilline / streptomycine	Gibco	15140
Des plaques 6 puits	BD-Falcon	35-1146	Non-TC traités
[Méthyl-3 H]-thymidine	Perkin Elmer	NET027Z001MC	1 mCi / ml
Micro-centrifugeuse tubes	Denville	C2170	1,7 ml
NaCl	Sigma	59888
KCl	Acros	42409
KH 2 </ Sub> PO 4	Acros	20592
MgSO 4	Acros	41348
CaCl 2	Acros	34961
HEPES	Sigma	H0887	Solution à 1 M
35% de BSA	Sigma	A7979
NaHCO 3	Acros	42427
D-glucose	Sigma	G8769
TCA	Fisher Scientific	SA9410-1	10% p / v
NaOH	Acros	12426
Tube de comptage à scintillation	Sarstedt	58.536	7 ml, PP
Bouchon du tube de comptage à scintillation	Sarstedt	65.816
Econo-Safe cocktail de comptage	RPI	111175
L'insuline RIA	Siemens	TKIN2
BCA Assay Kit	Thermo Scientific	23250
			Équipement
Centrifuger	Eppendorf	5415R
Comptage à scintillation portoir	Sarstedt	93.1431.001
Compteur à scintillation liquide	Perkin Elmer	Tri-Carb 2910TR