Cet article détaille comment utiliser à flux continu chambres hypoxie pour générer des atmosphères avec des concentrations définies de O 2 Pour comprendre les réponses biologiques à une diminution de O 2. Ce système est facile à installer et à entretenir, et suffisamment souple pour convenir à un large éventail de O 2 Les concentrations et les systèmes modèles
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Article de méthode
Création d'environnements gazeux définies pour étudier les effets de l'hypoxie sur la
Dans cet article
Résumé
Résumé
L'oxygène est essentiel pour tous les métazoaires à survivre, à une exception près connue 1. Diminution de la disponibilité d'O 2 (hypoxie) peuvent survenir pendant les états de la maladie, le développement normal ou changements des conditions environnementales 2-5. Comprendre les voies de signalisation cellulaires qui sont impliqués dans la réponse à l'hypoxie pourrait fournir un nouvel éclairage sur les stratégies de traitement pour diverses pathologies humaines, de course à un cancer. Cet objectif a été entravée, du moins en partie, par des difficultés techniques associées à l'exposition hypoxique contrôlée dans des organismes modèles génétiquement dociles.
Les nématode Caenorhabditis elegans est idéalement adapté comme un organisme modèle pour l'étude de la réponse hypoxique, comme il est facile de culture et de manipuler génétiquement. En outre, il est possible d'étudier les réponses cellulaires à hypoxiques spécifiques concentrations d'O 2 sans effets confondants depuis C. elegans obtenir O 2 (et d'autres gaz) par diffusion, par opposition à un système respiratoire facilitée 6. Facteurs connus pour être impliqués dans la réponse à l'hypoxie sont conservées dans C. elegans. La réponse réelle à l'hypoxie dépend de la concentration spécifique de O 2 qui est disponible. Dans C. elegans, l'exposition à l'hypoxie modérée provoque une réponse transcriptionnelle médiée en grande partie par HIF-1, les très conservées facteur de transcription hypoxia-inducible 6-9. C. elegans embryons exigent HIF-1 à survivre dans 5,000-20,000 ppm O 2 7,10 . L'hypoxie est un terme général pour "inférieure à la normale O 2". Normoxie (normal O 2) peut aussi être difficile à définir. On considère généralement l'air ambiant, qui est 210 000 ppm 2 O à la normoxie. Toutefois, il a été démontré que C. elegans a une préférence comportementale pour concentrations d'O 2 à partir de 5-12% (50,000-120,000 ppm 2 O) 11. Dans larvae et les adultes, HIF-1 agit pour prévenir l'hypoxie induite par la diapause en 5000 ppm 2 O 12. Toutefois, HIF-1 ne joue pas un rôle dans la réponse à de faibles concentrations de O 2 (anoxie, une définition opérationnelle <10 ppm 2 O) 13. En anoxie, C. elegans entre dans un état d'animation suspendue réversible dans laquelle toutes les activités observables au microscope cesse 10. Le fait que différentes réponses physiologiques se produisent dans des conditions différentes met en évidence l'importance d'avoir un contrôle expérimental sur la concentration de O 2 hypoxique.
Ici, nous présentons une méthode pour la construction et la mise en œuvre des chambres de l'environnement qui produisent fiables et reproductibles des conditions hypoxiques avec des concentrations définies de O 2. La méthode des flux continuel assure l'équilibration rapide de la chambre et augmente la stabilité du système. En outre, la transparence et laaccessibilité des chambres permettre une visualisation directe des animaux étant exposées à l'hypoxie. Nous avons en outre démontrer une méthode efficace de la récolte C. échantillons elegans rapidement après une exposition à l'hypoxie, ce qui est nécessaire pour observer un grand nombre des changements rapidement inversée qui se produisent dans 10,14 hypoxie. Cette méthode fournit une fondation de base qui peut être facilement modifié pour les besoins de chaque laboratoire, y compris des systèmes modèles différents et une variété de gaz.
Protocole
1. Construction de chambres de l'environnement
- Sélectionnez le plus petit volume raisonnable de la chambre requis pour la portée de votre projet. Chambre doit être composée de gaz (O 2) un matériau imperméable. Plats en Pyrex de cristallisation, des boîtes Anaeropack ou de grandes boîtes en acrylique coulé (Ellard Instrumentation), peuvent être utilisés. Nous avons constaté que 9 mm 50 plaques peuvent tenir dans un plat de 100 x 50 cristallisation Kimex. Les plaques de verre peut être utilisé comme couvercles pour les plats en Pyrex de cristallisation.
- Percez un trou dans la chambre choisie et monter avec un mâle en plastique à rac....
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Discussion
Cette méthode présente une stratégie pour construire un environnement hypoxique qui permet pour les environnements avec des concentrations précises d'oxygène pour être maintenus dans le laboratoire. Ces chambres offrent une méthode simple pour exposer les organismes à certains de faibles concentrations de O 2 et le suivi des sorties moléculaires et physiologiques. La chambre de l'environnement décrit est assemblé par le laboratoire au lieu de commerce achetés et peut donc être modifié pour s'adapt.......
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Déclarations de divulgation
Pas de conflits d'intérêt déclarés.
Remerciements
Nous remercions les membres du laboratoire Miller pour la discussion et la lecture critique du manuscrit. Ce travail a été soutenu par une bourse de nouveau chercheur du Centre de choc Nathan d'excellence dans la biologie fondamentale du vieillissement de DLM et le National Institutes of Health Award R00 AG030550 à DLM.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Nom du réactif | Entreprise | Numéro de catalogue | |
| Tubes (FEP et PTFE) | Cole Parmer Tygon | YO-95821-00 (1/8 "BCS) 06605-27 (1/16 x 1/8 "PTFE) 'R-3603 | |
| Raccords à compression | Seattle Fluid Systems | 06363-58 (M. coupleur 1/16 ") 06363-62 (F coupleur 1/16 ") 06363-60 (M. coupleur 1/8 ") 06363-61 (F coupleur 1/8 ") | |
| Le tube d'injection | Aalborg | PMR3-010073 (sortie 3) PMR1-013520 (1 sortie) | |
| Régulateur de débit massique | Sierra Instruments | 810S-L-DR-2-OV1-SK1-V1-S1 (messe Trak) C100L-JJ-2-OV1-SV1-PV2-V1-SO-C10 (Smart Trak 2) | |
| Réservoir de gaz comprimé | Airgas | Fabriqué à l'ordre | |
| Mâle en plastique aux raccords Luer cannelés | Cole Parmer | 45505-41 (série 500 1/16 ") | |
| Cast boîtes acryliques | Ellard Instrumentation | Fait sur commande | |
| Accessoires de tuyauterie (en laiton ou en acier inoxydable) | Seattle Fluid Systems | B-402-1 (1/4 "écrou) B-200-3 (1/8 "Té) B-400-ensemble (1/4 "embouts) B-QM2-B1-200 (QC corps QM) B-200-1-2 (1/8 x 1/8 "mâle conn) | |
| Graisse Dow Corning sous vide | Sigma-Aldrich | Z273554 | |
| Boîte de AnaeroPack | Société Misubishi Gas Chemical | R684004 (0,4 litre) R685025 (2,5 litre) R685070 (7,0 litre) | |
| Bouteille de gaz de lavage Pyrex | Sigma-Aldrich | CLS31770500C (500 ml) CLS31770250C (250 ml) CLS31770125C (125 ml) | |
| L'acide palmitique | Sigma-Aldrich | P0500 | |
| De chèvre anti-IgG de souris-peroxydase de raifort | Southern Biotechnology Associates | 1032-1005 | |
| SuperSignal Ouest substrat Chemiluminsecent Pico | Pierce Chemical | 34077 | |
| 100 x 50 plats de cristallisation de verre | Kimax Kimble | 23000 |
Références
- Danovaro, R. The first metazoa living in permanently anoxic conditions. BMC Biology. 8, 30(2010).
- Birner, P. Overexpression of Hypoxia-inducible Factor 1 alpha Is a Marker for an Unfavorable Prognosis in Early-Stage Invasive Ce....
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Réimpressions et autorisations
