Article de méthode

C. elegans Suivi et évaluation comportementale

DOI :

10.3791/4094

⸱

17 novembre 2012

 ,  ,  , 
1Donnelly Centre, University of Toronto, 2Department of Physics and Astronomy, Vrije Universiteit, 3Okinawa Institute of Science and Technology, 4Department of Physics, University of Toronto

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous avons développé un système de vidéo-microscope taux de suivi qui permet d'enregistrer et de quantifier C. elegans Comportement à haute résolution et haute vitesse. Nous avons également développé des méthodes de calcul afin de réduire la dimensionnalité des images à vis sans fin à un ensemble fondamental de mesures qui a complètement décrivent la forme du ver.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous avons développé des techniques d'analyse de l'instrumentation, traitement d'image, et les données pour quantifier le comportement locomoteur de C. elegans comme il rampe sur la surface d'une plaque de gélose. Pour l'étude de la génétique, biochimique base, et neuronales du comportement, C. elegans est un organisme idéal car il est génétiquement docile, prête à la microscopie, et montre un certain nombre de comportements complexes, y compris les taxis, l'apprentissage et l'interaction sociale 1,2. Analyse comportementale basée sur le suivi des mouvements des vers comme ils rampent sur ​​des plaques de gélose ont été particulièrement utiles pour l'étude du comportement sensorielle 3, de la locomotion 4, et en général phénotypage mutationnel 5. Notre système fonctionne en déplaçant le système de caméra et d'éclairage comme les vers rampe sur une plaque de gélose à l'arrêt, ce qui garantit l'absence de sollicitation mécanique est transmise à la vis sans fin. Notre système de suivi est facile à utiliser et comprend une fonction d'étalonnage semi-automatique. A challenge de tous les systèmes de suivi vidéo est qu'elle génère une énorme quantité de données qui est intrinsèquement dimensionnelle élevée. Notre traitement de l'image et les programmes d'analyse des données relever ce défi en réduisant la forme des vers en un ensemble de composants indépendants, qui complète reconstruire le comportement des vers en fonction de seulement 6,7 Dimensions 04.03. A titre d'exemple du processus, nous montrons que le ver entre et sort de son état d'une manière inversion de phase spécifique.

Protocole

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Description des microscopes de suivi

  1. Une plaque de gélose est éclairé par une source de lumière à fibres et visualisée à l'aide d'une caméra. Ce système est monté sur un X, Y étage de translation.
  2. L'étape est déplacé par la norme moteurs pas à pas, qui sont connectés à un contrôleur de moteur pas à pas.
  3. Le contrôleur de caméra et sont reliés à l'ordinateur et commandé par des programmes écrits dans la mesure LabVIEW.
  4. L'appareil photo des images de la surface d'une plaque de gélose et identifie les objets foncés sur un fond clair.
  5. La qualité d'image est réglée de sorte que le programme informatique permet de quantifier des objets en temps réel. Le gain, la luminosité et la vitesse d'obturation de la caméra peut être ajustée pour fournir un objet sombre sur un fond blanc.
  6. Une marque de calibrage pour le calibrage automatique se fait en poussant la surface de la gélose avec un choix sans fin.
  7. Le filtrée, l'image binaire qui est utilisée par le programme de suivi de piste peut être vérifiée.
  8. Ce que l'onftware a une fonction d'auto-calibration qui calcule la matrice de calibrage en déplaçant un objet de test à une distance fixe.
  9. Les distances en pixels est calibré pour les mesures prises par le moteur pas à pas par la matrice d'étalonnage.
  10. Après l'étalonnage, le système est prêt à fonctionner et n'a pas besoin d'être recalibré à moins que le grossissement est changé ou si l'appareil est remis en place.

2. Préparation des plaques de suivi et C. elegans pour suivi

  1. Un anneau en cuivre est utilisé pour réunir les vers et les empêcher de migrer vers le bord de la plaque. Le cuivre constitue une barrière chimique locale et n'affecte pas le mouvement de la vis sans fin par ailleurs pour la durée de l'expérience (<1 h). Chauffer le premier anneau en le plaçant sur un bloc de chauffage ou l'équivalent.
  2. Placer le cylindre sur une plaque de gélose fraîche (1,7% Bacto Agar, 0,25% de Bacto-peptone, 0,3% de NaCl, CaCl2 1 mM, 1 mM MgSO 4, 25 mM de tampon phosphate de potassium, 5 pg / mlcholestérol) et appuyer légèrement pour l'intégrer dans la surface de la gélose.
  3. Choisissez L4 scène ou vers adultes jeunes sur une plaque de gélose rempli d'une mémoire tampon NGM (0,3% de NaCl, CaCl2 1 mM, 1 mM MgSO 4, 25 mM de tampon phosphate de potassium) pour les laver de résidus alimentaires. Laissez-les vers nager pendant quelques minutes.
  4. Soigneusement placer une vis sans fin unique sur la plaque de centrage à proximité du centre de l'anneau. Et puis placez la plaque sur le tracker ver.

3. Suivi Worm

  1. Exécutez le programme LabVIEW et sélectionnez les options si nécessaire (emplacement pour les images, les types d'images, mesures, réglages de l'appareil).
  2. En utilisant le levier de commande de déplacer le microscope jusqu'à ce que l'image de la vis sans fin est dans le champ de vision (écran d'ordinateur). Appuyez sur "piste" pour engager le programme de suivi.
  3. Le programme d'ordinateur mesure effectivement les mouvements d'une image binaire filtrée comme indiqué et peut effectuer des mesures sur cette image en temps réel
  4. À l'arrièreer le suivi d'une reconstruction de la trajectoire globale peut être faite à partir des mouvements moteurs pas à pas, tandis que les changements de forme locale du ver peut être vu en détail.

4. Analyse des données

  1. Exécuter le script squelettisation (MATLAB) pour paramétrer les formes du ver. (Figure 2)
  2. Calculer modes propres des données squelettés. (Figure 3,4)
  3. Voir Figure 5. Lire légende de la figure ou des résultats représentatifs.

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Résultats

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Exemple: Lors de la recherche de nourriture, C. transitions elegans d'avant en arrière le mouvement, souvent effectuer une réorientation (oméga tour) avant de revenir à l'état de mouvement vers l'avant. Quantifier cette transition est importante pour comprendre les habitudes d'alimentation de mouvement et aussi dans le contrôle moteur du ver. Le pouvoir de révéler des détails subtils du comportement de locomotion peut être vu en utilisant notre dispositif suiveur.

A titre d...

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Discussion

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L'étude de la locomotion et du comportement naturel nécessite des techniques non invasives de suivi dans des partenariats avec des techniques de réduction des données. Ici, nous avons fait preuve d'un système facile à utiliser de suivi qui enregistre des images détaillées de C. elegans comportement tel qu'il traîne sur la surface d'une plaque de gélose. La quantité d'informations contenues dans ces images est vaste et de grande dimension, et nous avons également développé des méthodes pour r...

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Déclarations de divulgation

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Aucun conflit d'intérêt déclaré.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Nom de la partie Entreprise Numéro de catalogue Commentaires (optionnel)
Caméra CCD Basler A601f
Lentille Edmund Optics MMS série
Illumination de fibres Dolan Jenner DC-950H
Platine de translation Deltron LS3-4
Moteur pas à pas US numérique MS23C
Moteur pas à pas Gecko G201
Moteur pas à pas SimpleStep SSXYZ
Tout le code de programmation est disponible. S'il vous plaît envoyez un courriel de demande à l'auteur correspondant.

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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  2. de Bono, M., Maricq, A. V. Neuronal substrates of complex behaviors in C. elegans. Annu. Rev. Neurosci. (28), 451-501 (2005).
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