Article de méthode

Souris îlot de Langerhans isolement à l'aide d'une combinaison de la collagénase purifiée et protéase neutre

DOI :

10.3791/4137

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7 septembre 2012

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1Department of Pediatrics and the Herman B Wells Center for Pediatric Research, Indiana University School of Medicine, 2VITACYTE, LLC, 3Department of Medicine, Indiana University School of Medicine, 4Department of Cellular and Integrative Physiology, Indiana University School of Medicine

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Une description détaillée de la souris îlot isolement est décrit en utilisant la technique de la ponction du pancréas in situ canalaire et la perfusion d'une combinaison de collagénase purifiée et la protéase neutre.

Résumé

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L'interrogatoire de l'expression génique des cellules bêta et la fonction in vitro a carrément changé au fil des ans à partir de l'étude des lignées de rongeurs tumorigènes de cellules à l'étude des îlots isolés de rongeurs. Îlots primaires offrent l'avantage qu'elles reflètent plus fidèlement la biologie des voies de signalisation intracellulaires et les réponses sécrétoires. Considérant que la méthode d'isolement des îlots de tissu à l'aide d'enzymes dissociant (TDE) préparatifs a été bien établi dans de nombreux laboratoires de 1-4, les variations de la consistance du rendement et de la qualité de l'îlot n'importe quelle souche de rongeurs donnée limiter la portée et la faisabilité des études primaires îlots. Ces variations se produisent souvent à la suite des TDES brut partiellement purifiés utilisés dans la procédure d'isolement des îlots; TDES présentent souvent beaucoup à beaucoup variations de l'activité et nécessitent souvent des ajustements de la dose d'enzyme utilisée. Un petit nombre de rapports ont utilisé pour purifier TDES isolements cellulaires de rongeurs 5, 6 7, 8, dans lequel les TDES sont perfusés directement dans le canal pancréatique de souris, suivie d'un fractionnement du tissu brut par un gradient Histopaque 9, et l'isolement des îlots purifié. Une différence significative dans notre protocole est l'utilisation de la collagénase purifiée (CI enzyme MA) et neutre protéase (enzyme CI BP) combinaison. La collagénase a été caractérisé par l'utilisation d'un 6 collagène fluorescence activité (CDA) test dégradants qui ont utilisé marquées par fluorescence solubles fibrilles peau de veau comme substrat 6. Ce substrat est plus prédictif de la cinétique de dégradation du collagène dans la matrice de tissu, car il repose sur le collagène natif comme substrat. La protéase est CHaracterized avec un test sensible cinétique fluorescente 10. L'utilisation de ces tests améliorés ainsi que l'analyse biochimique plus traditionnelle activer le chiffrement transparent des données à fabriquer plus cohérente, conduisant à la cohérence entre les lots de meilleures performances. Le protocole décrit ici a été optimisé pour un rendement maximal et de la morphologie des îlots îlot optimale en utilisant C57BL / 6. Au cours de l'élaboration de ce protocole, plusieurs combinaisons de collagénase et de protéases neutres ont été évaluées à différentes concentrations, et le rapport final de la collagénase: protéase neutre de 35:10 représentent le rendement enzymatique comparable à Sigma Type XI. Parce que la variabilité importante des rendements des îlots moyenne de différentes souches de rats et de souris ont été signalés, des modifications supplémentaires de la composition TDE devraient être faits pour améliorer le rendement et la qualité des îlots de récupération à partir de différentes espèces et souches.

Protocole

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A. Matériel nécessaire: Voir le tableau 1 (réactifs) avant la préparation

  1. HBSS (P / S): 100 ml de HBSS 10X + 900 ml H 2 0 + 1% de pénicilline / streptomycine (stockée dans le réfrigérateur ou sur de la glace).
  2. 20% actions BSA est faite dans l'eau et aliquotés et conservés à -20 ° C.
  3. HBSS (BSA): 200 ml de HBSS 1X (P / S) + 3 ml de BSA 20% (concentrations finales BSA est de 0,3%)
  4. Islet moyenne: RPMI + 10% FBS + glutamine 1% + 1% de pénicilline / streptomycine
  5. Histopaque 1100: 240 ml 1119 Histopaque + 200 ml 1077 Histopaque
  6. Suture 4-0 (McKesson): couper en morceaux 2 ¾ pouces et stockés dans une boîte de Petri de 10 cm
  7. Instruments: Pliez la pince de Outils Fine Science à 90 °, et limer les dents crénelées de toutes les trois paires de pinces. L'objectif est de ternes les dents, ne pas les supprimer.
  8. Canule pour l'administration de la collagénase / protéase mélange: 27G ½ po aiguille, 30 ½ poaiguille, tube PE50 coupé en morceaux de 12 po. Déposer les deux aiguilles vers le bas jusqu'à une extrémité arrondie lisse qui n'a pas de bords tranchants. Insérer l'aiguille 27G dans une extrémité d'une pièce de 12 po PE50 tube. Retirez l'aiguille 30G de l'enveloppe en brisant le boîtier avec une paire de pinces, tournant le boîtier ¼ de tour à chaque fois. Retirer l'aiguille de la pince de l'enveloppe et de l'insérer dans l'autre extrémité de la tubulure PE50 sous un microscope à dissection. Veillez à ne pas plier le tuyau que vous insérez l'aiguille dans le tube PE50. L'aiguille 27G est la fin que vous allez fixer la seringue de la collagénase.
  9. Protéase collagénase (enzyme CI MA) et de neutre (CI enzyme BP). Reconstituer le TDE selon les instructions du fabricant. Reportez-vous au certificat spécifique du lot d'analyse pour calculer la concentration de l'activité enzymatique. Transférer un total de 350.000 collagène dégradantes d'activité (CDA) des unités de la collagénase reconstitué et 100.000 unités de protéase neutre de la reconstittribué protéase BP dans un tube conique et diluer jusqu'à 15 ml au total dans du HBSS (P / S)

B. Step-by-Step Protocole

1. L'inflation de pancréas avec la collagénase / protéase Mélange

  1. Euthanasier souris par dislocation cervicale, saturer le torse de la souris avec de l'EtOH 70%, cavité abdominale ouverte complètement de l'anus à membrane avec des ciseaux et des pinces à dissection.
  2. Placez la souris sur la plate-forme d'un microscope à dissection.
  3. Tirez le caecum et le côlon ascendant et de les mettre en dehors de la cavité du corps à votre gauche. Voir la figure 1 pour un résumé des étapes suivantes.
  4. Positionner les lobes du foie contre le diaphragme, ils doivent y rester si la cavité du corps est suffisamment ouvert. Trouvez l'artère hépatique, la veine porte et le faisceau voie biliaire conduisant dans le foie en saisissant le duodénum avec des pinces courbes. Avec une autre paire de pinces courbées, les mains sous l'artère, veine, et conduit bundle et tirez un 2 ¾ po morceau de suture 4-0 sous l'artère, veine voie biliaire, et l'attacher fois et serrer au plus près du foie que possible.
  5. L'utilisation de deux paires de pinces courbes, bien saisir le duodénum et de trouver la voie biliaire au duodénum attaché à la papille. Utilisez une pince de la pince à pointer à travers le pancréas et le tissu conjonctif droit sous l'étroite voie biliaire à la papille. Poke vos pinces rapidement à travers l'organe à faire un trou, puis mettre les deux pinces de pinces à travers et prendre un autre morceau de 2 ¾ de pouce de suture 4-0 grâce et l'attacher fois et tirez-le à un petit cercle, mais ne pas serrer.
  6. Modifier les 90 ° forceps et aux ciseaux Vannas Superfine. Avec les 90 ° pince, pincez et tirez soigneusement l'intestin grêle jusqu'à ce que le canal cholédoque est tendu. Faire une coupe horizontale à travers la papille avec les ciseaux en piquant les ciseaux ouverts dans l'intestin, puis couper avec un seul mouvement. Essayez de ne faire one recoupent la papille sans déloger la voie biliaire de la papille.
  7. Tout en maintenant l'intestin avec les 90 ° pince, insérez la canule dans le canal cholédoque jusqu'à la moitié de la longueur de la voie biliaire, puis tirez doucement le fil de suture serrée autour de la canule.
  8. Remplir une seringue de 3 ml avec 2,0 ml de collagénase / protéase mélange et les injecter dans la canule à un rythme lent et constant.
  9. Après le gonflage du pancréas est terminée, retirez la canule de la voie biliaire principale et utiliser les pinces et ciseaux courbes incurvées printemps pour enlever le pancréas gonflé en commençant par le côlon descendant et coupant le tissu conjonctif que vous tirez les intestins vers le haut. Continuer à supprimer le pancréas dans l'intestin jusqu'à ce que vous atteigniez le canal biliaire, puis retirez le pancréas de la rate, puis l'estomac, puis de les viscères de la cavité abdominale. Terminer la suppression en coupant les fils de suture loin. Ajouter le pancréas à un tube de 50 ml contenant 5 ml de HBSS(P / S). Ce tube doit être sur la glace.
  10. Répétez la procédure ci-dessus pour chaque animal jusqu'à quatre animaux. Pour des résultats optimaux, se dissocient seulement quatre pancréas en même temps. En règle générale, tandis que les quatre premiers sont dans le bain à 37 ° C de l'eau, on gonfle un autre pancréas quatre.

2. Pancréas dissociation

  1. Placer les tubes de 50 ml contenant du pancréas dans un bain d'eau à 37 ° C pendant 15 min.
  2. Secouez doucement le tube et vérifier pour la dissociation des tissus, assurez-vous de tissu se détache facilement, puis tourbillonner les tubes 12 fois pendant que vous tenez le tube par le couvercle.
  3. Ne pas ajouter plus de 30 ml de HBSS (BSA) (cela peut être un montant inférieur, en fonction de combien est nécessaire pour équilibrer les tubes pendant l'étape de centrifugation) et centrifuger à 290 xg pendant une minute.
  4. Aspirer le surnageant avec précaution et laisser une petite quantité de surnageant (2-3 ml) à la base afin de ne pas perturber le culot cellulaire.
  5. L'aide d'un seringue 30 ml d'Attached à 14G aiguille, ne pas ajouter plus de 10 ml de HBSS (BSA) et aspirer la suspension de haut en bas 2 fois.
  6. Filtrer le mélange de cellules à travers une passoire à thé en plastique dans un tube de 50 ml et rincer avec un autre HBSS 10 ml (BSA).
  7. Centrifuger à 330 xg pendant 2 min.
  8. Décanter le surnageant et inverser les tubes égoutter sur du papier absorbant pendant 1 minute.
  9. Resuspendre chaque tube de 10 ml à froid histopaque 1100.
  10. Superposez la histopaque avec 10 ml de HBSS (BSA) et centrifuger à 900 xg pendant 18 min.
  11. Retirez la totalité des 20 ml de surnageant à l'aide d'une pipette de grand alésage 25 ml et passer le surnageant à travers environ 70 um filtre inversées.
  12. Rincer les îlots dans un plat de Pétri de 10 cm par pipetage 10 médias îlots ml à travers le filtre en le tenant à l'endroit sur le plat.
  13. Culture des îlots dans un 37 ° C, 5% de CO 2 incubateur de culture tissulaire avant d'être prêt pour l'expérimentation. En règle générale, les îlots sont cueillies à la main et comptés avant experimentation.

3. Les résultats représentatifs

Rendements Islet, la morphologie et la qualité sont les paramètres généraux utilisés pour juger du succès de l'isolement des îlots. Dans nos mains, les rendements des îlots de la moyenne C57BL / 6 souris sont de l'ordre de 150-250 îlots qui utilisent ce protocole (voir le tableau 2), et sont comparables aux données obtenues en utilisant optimisé Sigma type XI collagénase. Cependant, les rendements peuvent varier en fonction de la souche de souris utilisée et l'âge de la souris. La plupart des animaux que nous utilisons sont dans la gamme de 8-16 ans semaine Ce protocole a été testé sur plusieurs souches de souris, y compris C57BL / 6 (180 à 250 îlots / souris), CD1 (200-300 îlots / souris), 129 / B6 (200-300 îlots / souris), BLKS-db/db (120-200 îlots / souris), NOD (10 semaines d'âge, 100-150 îlots / souris), et NOD-SCID (100-150 îlots / souris ). La morphologie des îlots typique est montrée à la figure 2, dans laquelle îlots faire un tour à la forme oblongue avec une taille relativement uniforme (bien que la taille uniformity peut varier d'une souche à l'autre). Figure 3 montre notre analyse typique du glucose stimulée par la sécrétion d'insuline à partir de souris C57BL / 6 îlots isolés à l'aide de la souris TDES purifiés vs Sigma type XI de la collagénase. Typiquement, un des résultats de haute qualité d'îlots de préparation à une stimulation par l'insuline à 25 mM de glucose qui est 6-20 fois supérieure à celle observée à 2,5 mM de glucose. D'autres applications peut également être utilisé pour tester la qualité d'îlots isolés, et il s'agit notamment de l'utilisation de techniques de périfusion, Ca 2 + d'imagerie (avec Fura2), et transcription inverse PCR, entre autres 11.

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Figure 1. Un résumé de la canulation du canal cholédoque.

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Figure 2. Aspect typique d'îlots C57BL / 6 à 24 h isolement suivant. Images ont été acquises sur un enmicroscope à un grossissement de 40X convertis.

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Figure 3. Stimulée par le glucose sécrétion d'insuline de souris C57BL / 6 îlots. A 24 h suivant l'isolement, 100 îlots ont été incubés dans un plat de 12 puits pendant 1 heure à 37 ° C dans de Krebs-Ringer HEPES solution tampon contenant 2,5 mM de glucose. Les îlots ont ensuite été transférés à Krebs-Ringer HEPES à 2,5 mM de glucose pendant une heure supplémentaire, après quoi le surnageant a été recueilli pour la mesure de l'insuline à l'aide d'une à deux sites immunospécifique-enzymatique (ELISA) (Crystal Chem). Les îlots mêmes ont ensuite été transférés à Krebs-Ringer tamponné HEPES contenant 25 mM de glucose et de l'insuline dans le milieu a été mesurée par ELISA après 1 heure d'incubation.

Discussion

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Dans ce protocole, nous avons décrit notre procédure de cathétérisme, perfusion de collagénase, et la dissociation du pancréas de souris, dans le but d'isoler les îlots de Langerhans. Techniquement, notre méthode, une fois maîtrisé, devrait permettre à l'isolement du pancréas moins de 4 min de l'euthanasie de l'animal, et en 1 heure devrait aboutir à l'isolement d'îlots à partir d'un seul animal. La rapidité de la technique nous permet d'isoler les îlots de jusqu'à 12 souris à un étirement typique, ce qui conduit à l'isolement de jusqu'à 3.000 îlots.

Contrairement à d'autres protocoles qui utilisent des préparations brutes de collagénase, notre protocole comprend l'utilisation de protéases purifiées, CI enzyme collagénase et MA CI enzyme protéase BP. Les variations de la consistance des préparations TDE qui sont disponibles dans le commerce exige que chaque lot soit individuellement testées et optimisées avant l'utilisation générale. Cette variabilité de lot à lot nous a conduit à envisager l'utilisation de puriTDES fiés de VitaCyte. Ces TDES hautement purifiés sont caractérisés par plusieurs méthodes, y compris l'utilisation de tests de fluorescence sensibles substrat marqué. Le dosage de fluorescence CDA est plus sensible aux différentes formes moléculaires de la collagénase qui ont des cinétiques différentes de collagène natif dégradants. Historique des dosages de substrats peptidiques fournir une évaluation incomplète de la collagénase. Caractérisation de la collagénase par des méthodes multiples assure une plus grande activité enzymatique entre les lots.

Sur la base de notre propre test en utilisant une variété de préparations de collagenase disponibles dans le commerce, nous avons constaté que les combinaisons d'enzymes purifiées donné reproductibles de lot à lot résultats. Les principaux avantages de l'utilisation de TDES hautement purifiés et rigoureusement caractérisée dans la présente demande sont une fois de la composition enzymatique optimale est définie, la cohérence de ses performances de lot à lot est assurée. Cette cohérence élimine le processus laborieux de qualification beaucoup normalement requispour les produits bruts de la collagénase ou enrichi. TDES purifiées également permettre des modifications supplémentaires de la composition afin d'améliorer le rendement et la qualité des îlots récupérés à partir de différentes souches de souris. Rapports compositions enzymatiques optimales pour l'isolement des îlots de différentes souches de souris peuvent être plus efficacement communiquées. Ceci, à son tour, conduit à une utilisation plus productive des ressources et une meilleure flexibilité dans la conception expérimentale.

Il ya beaucoup d'étapes essentielles qui peuvent affecter le résultat de l'isolement des îlots en utilisant notre protocole. Le premier est la nécessité de parvenir à l'inflation effective du pancréas au cours de la perfusion de la préparation enzymatique. Il est important de commencer l'inflation avec une force douce de la seringue, et augmenter la force que les gonfle pancréas. Il est utile de déplacer les intestins et le pancréas soulever lors du gonflage de sorte que la collagénase perfuse l'organe entier. Une autre étape importante est la force avec laquelle on secoue l'AFTE tubesr incubation à 37 ° C (étape 2,2). Nous avons constaté que le pancréas secouant durement contre le bouchon du tube provoque la fragmentation des îlots, mais sans aucune forme de dissociation mécanique à cette étape, les rendements des îlots peut chuter dramatiquement. Il est également impératif que lors de l'étape de dissociation avec la seringue (étape 2.5), une force de niveau moyen est appliqué pendant le mouvement de haut en bas avec le piston, ce qui assure la dissociation tissulaire adéquate avant l'étape de filtrage (2,6), où très peu de tissu doit être retenu sur le filtre passoire à thé. Enfin, la dernière étape à suivre attentivement l'aspiration de l'ensemble de 20 ml de HISTOPAQUE les îlots fractionnés. Bien que les îlots sont généralement à l'interface de la histopaque et HBSS, nous avons constaté que nous perdons îlots quand nous essayons de supprimer uniquement l'interface, au contraire, nous avons maintenant retirer la totalité des 20 ml à l'aide d'une pipette de grand alésage 25 ml. Nous avons ajouté la filtration à travers le filtre 70 um inversé (étape 2.11) afin d'éliminer la nécessité de centrifuge les îlots à plusieurs reprises pour laver la histopaque.

Déclarations de divulgation

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NDS, SAT, et RGM n'avez rien à déclarer. AGB auteur est employé par VitaCyte. Auteur MRC détient une participation dans VitaCyte.

Remerciements

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Ce travail a été financé en partie par des subventions du NIH R01 DK060581, R01 DK083583 (à la fois pour RGM).

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Nom du réactif Entreprise Catalogue #
HBSS 10X Life Technologies 14065
RPMI Fisher Scientific 10-040
BSA Sigma Aldrich tout
Histopaque 1077 Sigma Aldrich 10771
Histopaque 1119 Sigma Aldrich 11191
4-0 suture rouleau de 100 m McKesson 451521
Aiguille 14 g extrémité émoussée Fisher Scientific 14-8216M
Sciss Superfine Vannas Fisher Scientific 501778
Ciseaux courbes de printemps Fisher Scientific 14127
Pince courbes (2) Fisher Scientific 15914G
Pince courbes (pour 90 °) Outils Fine Science 11052-10
27G 1/2 pouces aiguille Fisher Scientific 305109
Aiguille 30G 1/2 pouce Fisher Scientific 305106
Tube PE Becton Dickinson 427411
Collagénase MA Vitacyte, LLC 001-2030
BP protéase Vitacyte, LLC 003-1000
Seringue de 3 ml Fisher Scientific 309585
Seringue de 30 ml Fisher Scientific 309650
70 um filtre Fisher Scientific 352350
10 cm 2 boîte de Pétri Fisher Scientific 351005
Passoire à thé en plastique Toute fourniture cuisine
Réactifs Tableau 1. Et équipement
Sigma type XI
(L010M8618) 		MA (100615)
BP (110329) 		MA (081104)
BP (100823) 		MA (091211)
BP (101109)
216 (± 74) 260 (± 45) 157 (± 37) 200 (± 4)

Tableau 2. Rendements îlots moyen (± SD) en utilisant des lots différents TDE *

* Les données représentent la moyenne des rendements des îlots d'au moins 10 souris. Les numéros de lot entre parenthèses

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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Mots-clés

Mouse Islet IsolationPancreatic Duct CannulationHistopaque GradientTissue DissociationEyelet MorphologyGlucose Stimulated Insulin SecretionEnzyme Performance ConsistencyC57BL 6 Mice

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