Article de méthode
Une technique d'imagerie pour le suivi de l'évolution du potentiel de membrane avec une résolution spatiale sous-micrométrique et sub-milliseconde temporelle est décrit. La technique, basée sur une excitation laser de la tension de colorants sensibles, permet de mesurer des signaux dans les axones et les collatéraux axone, des branches dendritiques et terminaux individuels épines dendritiques.
Comprendre les propriétés biophysiques et l'organisation fonctionnelle des neurones individuels et la façon dont ils traitent l'information est fondamentale pour comprendre comment fonctionne le cerveau. La fonction principale de toute cellule nerveuse est de traiter des signaux électriques, le plus souvent à partir de sources multiples. Propriétés électriques des processus neuronaux sont extraordinairement complexe, dynamique, et, dans le cas général, impossible de prévoir en l'absence de mesures détaillées. Pour obtenir une telle mesure il faudrait, idéalement, aiment être en mesure de suivre, sur plusieurs sites, événements infraliminaires comme ils voyagent sur les sites d'origine sur les processus neuronaux et Additionnez à des endroits particuliers pour influencer l'initiation du potentiel d'action. Cet objectif n'a pas été atteint dans n'importe quel neurone raison de limitations techniques de mesures qui emploient des électrodes. Pour pallier cet inconvénient, il est hautement souhaitable de compléter l'approche patch-électrode avec les techniques d'imagerie qui permettent une vaste recordin parallèlegs de toutes les parties d'un neurone. Ici, nous décrivons une telle technique - enregistrement optique des transitoires du potentiel de membrane avec organiques sensibles à la tension colorants (V m-imagerie) - caractérisées par des sous-milliseconde et sub-micrométrique résolution. Notre méthode est basée sur un travail de pionnier sur les sensibles à la tension des sondes moléculaires 2. De nombreux aspects de la technologie initiale ont été continuellement améliorée au cours de plusieurs décennies 3, 5, 11. En outre, les travaux antérieurs documentés deux caractéristiques essentielles de V m-imagerie. D'une part, des signaux de fluorescence sont linéairement proportionnelle au potentiel de membrane sur toute la plage physiologique (-100 mV à +100 mV; 10, 14, 16). D'autre part, les neurones de chargement du colorant sensible à la tension utilisée ici (JPW 3028) n'a pas détectables effets pharmacologiques. L'élargissement du pic enregistré lors du chargement de teinture est complètement réversible 4, 7. En outre, les preuves expérimentales montrent qu'il est possible d'obtenir desun nombre important (jusqu'à plusieurs centaines) d'enregistrements avant les effets phototoxiques détectables 4, 6, 12, 13. À l'heure actuelle, nous profitons de la luminosité et la stabilité d'une source de lumière laser à longueur d'onde quasi-optimale pour maximiser la sensibilité du V m-technique d'imagerie. La sensibilité actuelle permet des enregistrements multi-sites optique de m Transitoires V de toutes les parties d'un neurone, y compris les axones et les collatéraux axone, des branches dendritiques de terminaux, et des épines dendritiques individuelles. Les informations acquises sur les interactions de signaux peuvent être analysées quantitativement ainsi que directement visualisée sous la forme d'un film.
1. Installation de l'équipement
Étape 1.1. L'installation d'imagerie
La clé de l'enregistrement de signaux de tension colorants sensibles est la conception configuration appropriée. Nous utilisons un microscope droit (BX51WI Olympus ou Zeiss AxioExaminer) équipé de trois caméras. L'installation d'éclairage est conçu pour les neurones individuels dans des tranches de cerveau par la lumière d'excitation en épi-fluorescence, microscopie en mode grand champ en utilisant soit Nikon 60X/1.0 NA ou NA Zeiss 63X/1.0 eau de trempage objectifs. Nos microscopes sont boulonnés à une table isolation contre les vibrations et équipé d'estrades mobiles motorisés. Chaque microscope est équipé de trois ports caméra. Un port de la caméra a une norme à haute résolution spatiale caméra CCD pour DIC vidéo-microscopie infrarouge (IR-1000, Dage MTI, Etats-Unis). Le port seconde caméra dispose d'une caméra d'acquisition de données rapide (jusqu'à 20 kHz fréquence d'image) avec une résolution spatiale relativement faible (80 x 80 pixels), mais remarquable gamme dynamique (14 bits) et exceptionnellement basse lirebruit (NeuroCCD-SM, RedShirtImaging LLC, Decatur, Géorgie). Le port de l'appareil a une troisième caméra CCD à haute résolution spatiale (PixelFly, 1392x1024 pixels; PCO AG, Allemagne) monté sur un dispositif de balayage à foyer commun de filage-disque (CSU-10, Yokogawa, Japon) utilisés pour collecter les piles de z images confocales pour détaillée reconstruction morphologique de la cellule colorée. Un pompé par diode doublé en fréquence Nd: YVO4 laser continu (400 mW) émettant à 532 nm (mW MLL-III/400; CNI, Changchun, Chine) est la source de lumière d'excitation. Le faisceau laser 2 mm de diamètre fermé par un obturateur (LS6; Partenaire Vincent) est dirigé vers un guide de lumière couplé au microscope par l'intermédiaire d'un condenseur à épifluorescence à port unique (TILL Photonics GmbH, Gräfelfing, Allemagne) destinée à déborder de l'ouverture arrière de l' objectif et fournir un éclairage uniforme à proximité du plan d'objet. La lumière laser est utilisé à la place d'un classique xénon lampe à arc à maximiser la sensibilité de V m-imagerie par: (1) l'aide d'un ex monochromatiqueRéférence à la lumière de l'aile rouge du spectre d'absorption de maximiser V m sensibilité du colorant 9, 10 et (2) en augmentant l'intensité de la lumière d'excitation au-delà du niveau qui peut être atteint par une lampe à arc. La lumière d'excitation est réfléchie à la préparation par un miroir dichroïque avec une longueur d'onde centrale de 560 nm et la lumière de fluorescence a été enregistrée passer à travers un filtre de 610 nm barrière (Schott RG610 un). L'effet combiné de l'augmentation de l'intensité de la lumière et de l'utilisation de longueurs d'onde d'excitation optimal près monochromatiques eu une amélioration spectaculaire de la sensibilité de l'imagerie tension par un facteur d'environ 50 par rapport aux mesures précédentes 6.
L'étape 1.2. Ajuster afin d'obtenir un éclairage uniforme
Utilisez une lame de fluorescence (excitation vert / rouge émission). Insérer appropriées filtres neutres dans le trajet du faisceau laser de sorte que le capteur CCD n'est pas saturé. Concentrer l'objectif sur la surface d'le coulisseau. Ajuster la position de l'extrémité de réception du guide de lumière quartz en face de l'objectif laser lanceur, et ajuster la position de l'extrémité de sortie du guide de lumière fixé à l'aide d'actionneurs appropriés microscope sur le condenseur épifluorescence pour atteindre centrée et uniforme éclairage du champ de vue.
L'étape 1.3. Déterminer le bruit de vibration
Placez une marque à l'encre noire sur la petite surface de la lame de fluorescence. L'intensité de la lumière avec enregistrement NeuroCCD dans le mode d'enregistrement continu. Mettre l'accent sur l'objectif d'un bord sombre de la marque à l'encre noire. Enregistrer l'intensité lumineuse d'environ 100 ms à 2 kHz fréquence d'image. Afficher la moyenne spatiale des traces fractions d'intensité de lumière (AF / F) de 20 ~ pixels recevant la lumière provenant de la zone éclairée de manière uniforme et de ~ 20 pixels le long du bord de la marque d'encre. L'excès de bruit dans les enregistrements de pixels avec des bords à contraste élevé reflète le bruit de vibration enle système.
Étape 1.4. Isolation contre les vibrations
Il est obligatoire de réduire les vibrations à l'aide d'une table de vibration isolement à un niveau inférieur au bruit de grenaille à des intensités lumineuses comparables aux conditions expérimentales d'enregistrement. Régler la table d'isolation de vibration jusqu'à ce que le bruit de vibration de l'intensité lumineuse de pixels couvrant l'arête vive de cette image est négligeable. Aucune de ces équipements avec les pièces mobiles (volets mécaniques, ventilateurs) peuvent être montés sur la table. Les câbles de l'équipement sur le tableau joint à d'autres composants qui ne sont pas isolés de vibration doit être desserré de manière à ne pas transmettre des vibrations mécaniques à la loupe.
2. Sélection d'un Neuron appropriée pour V m-imagerie
Étape 2.1. Sélection de neurones
Faire des tranches de cerveau selon des procédures standard. Utilisez une lignée de souris exprimant l'EGFP dans les cellules nerveuses individuelles de intérêt. Avec un système confocal à disque rotatif, de visualiser les neurones EGFP étiquetés dans la tranche. Sélectionner neurones pour V m-imagerie avec intactes dendritiques / axonale arbres, et les processus en cours d'exécution parallèle et proche de la surface de la tranche. Cela ne peut être accompli en souris de type sauvage parce axones et des dendrites fines, pour la plupart, ne sont pas visibles en mode microscopie DIC.
3. Les neurones de chargement avec tension sensible Dye
L'étape 3.1. Le remplissage de la pipette de patch
Remplir les pipettes en verre plaquées avec de l'extrémité libre de colorant intracellulaire solution par application d'une pression négative pendant environ 15 s à 2/3 de la conicité de l'électrode. La solution de colorant libre dans la pointe est nécessaire pour empêcher le déversement de teinture sur la tranche qui augmente la fluorescence de fond et réduit considérablement le rapport signal sur bruit. Remblayage de l'électrode avec la solution contenant le colorant sensible à la tension de membrane imperméant JPW3028 dissousen solution intracellulaire (0,8 mM).
JPW3028, la sonde de tension le plus de succès pour une application intracellulaire, est un analogue de doublement chargés positivement de la série de ANEP lipophiles colorants de styryle qui est encore suffisamment soluble dans l'eau à utiliser pour la micro-injection. L'analogue de di-éthyl de ce colorant a pratiquement les mêmes caractéristiques (y compris la tension sensibilité) et est commercialement disponible sous JPW1114 (voir tableau 1). Nous préparons une solution à 20 mM dans l'eau distillée actions H 2 O. Aliquotes de 50 pl de la solution mère sont conservés congelés à -20 ° C. Pour la concentration de colorant finale de 0,8 mM, 2 pl de la solution mère est dissous dans 50 ul de solution intracellulaire sur le jour de l'expérience. La solution de colorant stock est stable et peut être conservé à température ambiante pendant plusieurs mois. Ainsi, nous gardons un 50 aliquote ul à température ambiante jusqu'à ce qu'il soit épuisé.
Étape 3.2. Établir un giga-joint rapidement
Patch un neurone sélectionné précédemment et de permettre la libre diffusion du colorant à partir d'une pipette de patch somatique au soma dans la configuration cellule entière pour 20-45 min. Il est essentiel d'obtenir une étanchéité aussi vite que possible afin que la quantité de colorant sans solution dans l'embout peut être maintenue petite. Commencez par pratiquer patcher rapidement sans le colorant dans l'électrode. Neurones Ensuite, la pratique de ragréage et de chargement avec le colorant dans le but d'utiliser une quantité minimale de colorant sans solution à la pointe sans contaminer le tissu environnant. Avec la pratique, il est possible d'établir un joint dans 1-2 min.
L'étape 3.3. Surveiller le niveau de coloration
Au cours de la diffusion du colorant dans la configuration à cellules entières, de surveiller l'état physiologique du neurone par enregistrement des potentiels d'action évoqués dans le mode courant de serrage. En outre, surveiller la quantité de coloration en enregistrant l'intensité lumineuse de repos (RLI) du corps cellulaire à une cadence de 2 k Hz et à une fraction de l'intensité lumineuse pleine ajusté avec filtres de densité neutre (nous utilisons 0,04% de l'intensité de la lumière laser provenant d'un laser 400 mW). Continuer le processus de chargement jusqu'à ce que le colorant potentiel d'action commence à élargir, généralement après 20-40 minutes, en fonction de la taille de l'électrode et de la résistance.
L'élargissement de la pointe est complètement réversible et très probablement due à l'effet de charge capacitive de la concentration de saturation du colorant dans la membrane somatique. La forme d'onde de la pointe est complètement rétablie après la concentration de colorant est équilibrée tout au long du neurone.
L'étape 3.4. Retirer l'électrode de colorant
À la fin de la période de coloration, tirer doucement la pipette de patch loin du soma en configuration de verrouillage de tension en sorte que la transition de l'ensemble des cellules de la configuration de patch outside-out est atteinte dans le processus.
L'étape 3.5. Attendez diffusion du colorant
ent "> Incuber la tranche pendant un temps supplémentaire de 1,5 à 2 heures à température ambiante pour permettre la colorant sensible à la tension de se propager dans des processus neuronaux. Après une quantité importante de colorant diffuse pas de la soma dans les processus dendritiques et axonales, la forme d'onde de l'AP est entièrement restaurée.4. Enregistrement optique
Étape 4.1. Sélectionner un compartiment cellulaire de formation d'image
Localisez le soma du neurone teinté en fluorescence de faible niveau et re-patcher le neurone avec une électrode de patch (sans colorant) standard sous DIC. Visualisez les processus neuronaux sous faible intensité lumineuse à une cadence de 10-40 Hz dans le mode d'enregistrement continu de la CCD pour la tension d'imagerie. Réduire le niveau de lumière avec des filtres de densité neutre au minimum requis pour visualiser l'objet d'intérêt. Nous utilisons 0,01% de l'intensité laser 400 mW lors du positionnement du neurone teinté. En utilisant une table XY, positionner le processus neuronal d'intérêt en til milieu de la zone d'imagerie. Protéger le soma de la lumière d'excitation en utilisant l'iris champ partiellement fermé arrêt du microscope. Protéger le soma de l'intensité lumineuse d'excitation élevé permettra de réduire considérablement les dommages photodynamique pendant l'enregistrement.
Étape 4.2 Enregistre des signaux optiques liées aux transitoires du potentiel de membrane
Enregistrer des signaux optiques liées aux points d'accès backpropagated dans les différents branches dendritiques. Enregistrer des signaux optiques liées aux points d'accès dans l'axone. Enregistrer des signaux optiques liées à backpropagating points d'accès dans les épines dendritiques. Utilisez cadences appropriées pour la reconstruction précise de forme d'onde du signal et maintenir les périodes d'enregistrement et l'exposition à la lumière à haute intensité d'excitation aussi courte que possible pour minimiser blanchiment des couleurs et des dommages photodynamique. Par exemple, l'examen de la séquence d'amorçage et de propagation des potentiels d'action unique dans l'axone nécessite des périodes d'enregistrement de 5-10 msec. L'intensification de lumière d'excitationté lors de l'enregistrement est un compromis entre le rapport signal-sur-bruit d'une part et le degré de blanchiment des couleurs et dégâts photodynamique, d'autre part. Nous utilisons 100% de l'intensité du laser de 400 mW lors de l'enregistrement de longues sections d'axones lors d'une superficie de 300 m de diamètre est illuminé. Lorsque la lumière d'excitation est focalisé sur une zone de diamètre 30 um pour l'imagerie épines dendritiques, on utilise 10-25% de l'intensité de la lumière laser. La durée requise de l'enregistrement est un déterminant important de l'intensité lumineuse d'excitation optimal; périodes d'enregistrement plus courts permettent des intensités lumineuses plus élevées. L'intensité de l'éclairage optimal est mieux déterminée empiriquement pour chaque préparation et les paramètres de mesure.
5. Analyse des données
Étape 5.1. Corriger les données brutes pour les erreurs connues
L'analyse et l'affichage des données ont été réalisées en utilisant le programme NeuroPlex (RedShirtImaging) écrit en IDL (ITT Visual Information Solutions, Boulder, Colorado) et visuels personnalisés routines de base. Dans les conditions de faible luminosité, la fluorescence de fond devient un déterminant significatif de la taille du signal AF / F. Les données brutes ont d'abord été corrigé pour cet effet en soustrayant l'intensité de fluorescence de fond moyenne déterminée à partir d'une zone sans tache sur la tranche. Par la suite, le logiciel d'alignement de signal est utilisé pour corriger la gigue temporelle dans AP initiation ainsi que pour de petits mouvements possibles de la préparation durant en moyenne. Dans le domaine temporel, des signaux AP ont été alignées par corrélation croisée des points d'accès enregistrés électriquement à chaque essai au signal de référence acquise au début de la moyenne (figure 1B). Dans le domaine spatial, les images ont été alignées en deux dimensions hors ligne par l'image de corrélation croisée pour compenser d'éventuelles petits mouvements latéraux de la préparation. La mise au point correcte de l'image dans la dimension z est vérifiée avant chaque épreuve individuelle; smal ajustements l étaient souvent nécessaires. Les signaux spatialement et temporellement alignées ont été en moyenne comme indiqué dans la figure 1B. Changements lents de l'intensité lumineuse due à un blanchiment du colorant ont été corrigés en divisant les données par une fonction exponentielle appropriée double dérivée à partir des essais d'enregistrement sans stimulation (figure 1B). La forme d'onde du signal AP a été reconstitué à partir d'un ensemble de points de données à l'aide cubique interpolation de cannelure, une courbe continue par morceaux passant par chaque point de données. Pour confirmer que le signal de colorant sensible à la tension suit le potentiel de membrane sans distorsion significative à l'échelle de temps milliseconde, le signal électrique AP du soma a été comparé au signal optique AP de la butte adjacente axone comme le montre la figure 3B. Les deux signaux se superposent très près, ce qui permet le bruit de grenaille dans l'enregistrement optique.
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Figure 1. L'analyse des données (Animation). (A) Panneau supérieur: image haute résolution confocale d'un neurone colorées avec axone en position d'enregistrement. Électrode d'enregistrement attaché à soma et extracellulaire électrode de stimulation à côté de dendrites basales représenté schématiquement. Les potentiels d'action évoqués par extracellulaire, la stimulation synaptique. Panneau inférieur: image à faible résolution spatiale de fluorescence de l'axone obtenu par le CCD utilisé pour l'imagerie m V (B) Des enregistrements d'électrode de soma (traces noires), des enregistrements optiques du système AIS (traces rouges), et à partir du nœud de Ranvier (traces vertes). . Top des traces: des données brutes de 9 essais montrant la gigue temporelle AP initiation. Deuxième rangée de traces: le temps des signaux alignés. Troisième rangée de traces: signal moyen. Quatrième rangée de traces: correction javel. Traces de fond: Interpolation spline cubique avec un passage de lissage temporel.
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Succès microscopie confocale doit permettre une identification claire des processus neuronaux intacts qui sont proches de la surface de la tranche et situé dans un plan de mise au point. La sélection des cellules nerveuses qui sont appropriés pour l'imagerie de tension avant le chargement colorant sensible à la tension est critique. Un exemple des images confocales de L5 neurones pyramidaux exprimant l'EGFP dans une tranche corticale (Crym souris transgénique ligne) est montré dans la figure 2. Les axon...
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Cet article décrit une méthode sensible à la tension colorant d'enregistrement pour surveiller l'activité électrique des neurones individuels avec les sub-micrométrique et sous-milliseconde résolution spatio-temporelle. Excitation laser à longueur d'onde quasi-optimale (en ce qui concerne la taille du signal) a amélioré la sensibilité de l'enregistrement d'un facteur ~ 50 par rapport aux approches précédentes. La sensibilité actuelle permet de surveiller des signaux électriques de toutes les parties ...
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Dejan Zecevic déclare qu'il est le co-propriétaire de RedShirtImaging LLC., Une société spécialisée dans la haute-vitesse, faible bruit caméras CCD utilisés dans l'enregistrement colorant sensible au voltage. Tous les autres auteurs ne rapportent aucun intérêt financier ou de conflits d'intérêts potentiels liés à l'étude en cours.
Nous sommes reconnaissants à nos collaborateurs Knut Holthoff, Arthur Konnerth et Marco Canepari qui ont participé au développement initial de cette technique ainsi que pour Leslie M. Loew a bien voulu fournir des colorants. Soutenue par des subventions NSF grant IOS-0817969, NIH NS068407 et M136043 et par Kavli Institute for Neuroscience à l'Université Yale.
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| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Nom du composant | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires (optionnel) |
| Composants d'installation | |||
| Microscope vertical | Olympus Inc | BX51WI | Avec trois ports caméra |
| Motorisé mobile scène | Siskiyou | MXOPi.2 | |
| Epi-fluorescence Condenseur pour Olympus BX51 | TILL Photonics | 0000-560-11659 | |
| Microscope vertical | Carl Zeiss, LLC | D1 AxioExaminer | Avec trois ports caméra |
| Motorisé Plateau supérieur | Scientifica limitée | MMBP | |
| Épifluorescence Zeiss Condenseur pour AxioExaminer | TILL Photonics | ||
| Caméra d'acquisition de données | RedShirtImaging LLC | NeuroCCD-SM | À grande vitesse, le bruit de lecture bas |
| CCD IR-DIC | Dage-MTI | IR-1000 | |
| Spinning Disc-scanner confocal | Yokogawa | CSU-10 | |
| CCD haute résolution spatiale sur Scanner confocale | PCO AG | PixelFly | 1392x1024 Pixel |
| CW DPSS Laser (532 Nm) | CNI Optoélectronique Tech. Co., Ltd | MLL-III-532 400mW | Source lumineuse d'excitation |
| Lanceur de fibre multi-mode | Siskiyou | SM le financement du terrorisme | |
| Guide de lumière | TILL photonique | 0000-515-11524 | |
| Obturateur | Associés Vincent | LS6 | |
| Tableau isolation contre les vibrations | Moins k Technology | MK26 | |
| Des réactifs spécifiques | |||
| Di-2-ANEPEQ (JPW 1114) | Life Technologies | D-6923 | Tension colorant sensible |
| Ligne Souris Crym-EGFP | Gensat (MMRRC) | IMAGES Tg (Crym-EGFP) GF82Gsat/Mmcd | Exprimant l'EGFP peu dans la couche 5 neurones corticaux |
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