Suivi cellule à l'aide protéines photoconvertible cours de développement poisson zèbre

Résumé

Ici, nous présentons une méthode pour l’interrupteur photoactivé des protéines fluorescentes photoconvertibles (PCFP) dans l’embryon de poisson-zèbre vivant et un suivi ultérieur de la protéine photoconvertie à des moments spécifiques du développement. Cette méthodologie permet de surveiller les événements biologiques cellulaires sous-jacents à différents processus de développement chez un organisme vertébré vivant.

Résumé

L’embryogenèse est un processus dynamique qui est mieux étudié en utilisant des techniques qui permettent de documenter les changements de développement in vivo. L’utilisation de protéines fluorescentes codées génétiquement s’est avérée être une stratégie précieuse pour élucider les processus morphogénétiques dynamiques tels qu’ils se produisent dans l’organisme intact. Au cours de la dernière décennie, le développement de protéines fluorescentes photoactivables et photoconvertibles a ouvert la possibilité d’étudier le devenir de sous-populations discrètes de protéines marquées¹. Contrairement aux protéines photoactivables, les protéines fluorescentes photoconvertibles (PCFP) sont facilement suivies et imagées dans leur état d’émission natif avant la photoconversion, ce qui facilite l’identification et la sélection des régions par inspection optique. Les PCFP, tels que Kaede², KikGR³, Dendra⁴ et EosFP⁵, peuvent passer du vert au rouge lors d’une exposition à la lumière UV ou bleue grâce à une séquence tripeptide His-Tyr-Gly qui forme un chromophore vert qui peut être photoconverti en un chromophore rouge par une β-élimination catalysée par la lumière et l’extension ultérieure d’un système π-conjugué³. Les PCFP et leurs variantes monomères sont des outils utiles pour suivre les cellules^{6 à 10} et étudier la dynamique des protéines^{11 à 14}, respectivement. Au cours des dernières années, les PCFP ont été exprimés dans différents modèles animaux, tels que le poisson-zèbre⁶, le poulet^7,8 et la souris^9,10 pour le suivi du destin cellulaire. Ici, nous rapportons un protocole pour la photoconversion cellulaire des PCFP dans l’embryon de poisson-zèbre vivant et un suivi plus approfondi des protéines photoconverties aux stades ultérieurs du développement. Cette méthodologie permet d’étudier, de manière tissulaire, les événements biologiques cellulaires sous-jacents à la morphogenèse dans le modèle animal du poisson zèbre.

Protocole

1. Obtention d’embryons pour l’essai de photoconversion

Lors du croisement de poissons-zèbres transgéniques exprimant un PCFP, les embryons homozygotes les plus brillants sont choisis et cultivés à 28,5 °C jusqu’au stade embryonnaire¹⁵ souhaité.

Note 1 : Cette présélection permettra de scanner des embryons avec une faible puissance laser, empêchant ainsi la phototoxicité et le photoblanchiment.

Note 2 : Nous suggérons d’utiliser une lumière de faible intensité lors de la visualisation des embryons et de les maintenir dans des conditions d’obscurité en raison de la sensibilité élevée des PCFP, tels que Kaede et KikGR, à l’exposition à la lumière, y compris la lumière du jour.

2. Intégration

1. Dans un récipient en verre avec de l’eau d’œuf, déchotionner les embryons au stéréomicroscope à l’aide d’une pince
.
2. Anesthésier les embryons en transférant un embryon déchorionné dans une solution de tricaïne à 0,16 mg/ml (3-amino benzoïque, Sigma-Aldrich) (40 μl de solution mère à 4 mg/ml dans 1 ml de milieu E3 1X).

Remarque 1 : Transférer les embryons à l’aide d’une pipette en verre ou d’une pointe coupée (P1000) pour minimiser le risque d’endommager les embryons.

Note 2 : Les jeunes embryons déchorionnés ne doivent pas être exposés à l’air ou soulevés jusqu’à l’interface eau/air, car les œufs se rompent facilement lorsqu’ils sont soumis à un stress mécanique.

3. Transférez l’embryon anesthésié sur le couvercle d’une boîte de culture et maintenez l’embryon dans le plus petit volume possible de milieu.
4. Transférez l’embryon dans de l’agarose en le pipetant avec de l’agarose à basse température de fusion à 1 % (LMA, Lonza) à 30 °C contenant 0,16 mg/ml de tricaïne, et placez-le sur le verre de couverture d’une boîte de culture à fond de verre (MatTek Corp., Ashland, MA, États-Unis). Ensuite, orientez l’embryon à l’aide d’une pointe en plastique lisse (par exemple une pointe de pipette Microloader coupée, Eppendorf) et, lorsque le LMA a polymérisé, recouvrez l’agarose avec une solution de tricaïne de 0,16 mg/ml.

Note 1 : Faire fondre 1 % de LMA à 60 °C et maintenir l’agarose fondue à 30 °C.

3. Photoconversion

1. Sur un microscope confocal inversé équipé d’une source laser de 405 nm, 488 nm et 561 nm, tel que le Zeiss LSM 710, visualisez l’échantillon par un balayage z-Stack couvrant toute la structure de l’échantillon à photoconvertir et à suivre ultérieurement à l’aide du laser 488 nm (c’est-à-dire laser Ar de 30 mW, à une intensité de 5 à 7 %, détecteur réglé à 493-540 nm) et du laser de 561 nm (c’est-à-dire, laser DPSS 561 de 10 mW, d’une intensité de 7 à 9 %, détecteur réglé à 587-651) pour balayer les tissus/organes à la recherche de la fluorescence verte et rouge des protéines photoconvertibles, respectivement.

Remarque 1 : Pour le balayage avant photoconversion, nous avons utilisé un objectif Plan Apochromat 20x/NA 0.8.

Remarque 2 : Toujours rechercher la fluorescence rouge avant l’expérience pour exclure la présence de tout PCFP converti en rouge généré accidentellement.

2. Sélectionnez l’outil Série chronologique et réglez-le pour 2 cycles sans intervalle (un pour la pré- et un pour la post-photoconversion).
3. Sélectionnez l’outil Régions et définissez une ou plusieurs régions d’intérêt (ROI) pour la photoconversion.

Remarque 1 : Nous recommandons de déterminer d’abord la précision avec laquelle la région réellement photoconvertie par le laser à balayage dans le ROI correspond au ROI sélectionné dans le logiciel en mesurant la surface des tissus/cellules photoconvertis dans les trois directions (xy et z) dans un échantillon fixe où aucun mouvement de cellule ou de protéine n’est attendu. Pour les paramètres décrits dans cette application, le retour d’intérêt correspondait à la région photoconvertie avec une grande précision, mais cela dépend de l’objectif utilisé et de la quantité de laser appliquée pour la photoconversion. La taille du retour sur investissement peut être réduite à la taille d’une seule cellule en fonction de l’ouverture numérique de l’objectif, du facteur de zoom et de la quantité de lumière laser utilisée pour la photoconversion.

4. Sélectionnez l’outil Blanchiment et configurez-le pour commencer le blanchiment après le balayage 1 sur 2. Nous avons utilisé un laser à diode de 30 mW 405 nm pour la photoconversion et avons soigneusement optimisé la quantité minimale de lumière laser nécessaire pour une photoconversion complète, ce qui est principalement réalisé en faisant varier l’intensité de la lumière laser, les itérations de balayage du retour sur investissement et le temps de pixel (c’est-à-dire la vitesse de balayage).

Remarque 1 : Pour la photoconversion, nous avons utilisé un objectif Plan Apochromat 20x/NA 0.8.

Remarque 2 : La puissance du laser et le nombre d’itérations doivent être déterminés empiriquement pour chaque cadre expérimental et doivent assurer la photoconversion complète du PCFP vert au rouge dans le cadre du retour d’intérêt avec la quantité minimale nécessaire de lumière laser pour réduire la phototoxicité. Nous recommandons de lancer les tests en utilisant une faible puissance laser (par exemple 3 %, correspondant à 0,03 mW dans le plan d’objectif) combinée à un faible nombre d’itérations (par exemple 20), et d’augmenter ensuite la puissance du laser jusqu’à ce que la photoconversion complète soit obtenue qui, entre nos mains, était de 10 % de puissance laser (correspondant à 0,1 mW dans le plan d’objectif). Dans ces conditions, tous les embryons testés ont survécu au plan de traitement. Néanmoins, nous avons observé que la membrane vitelline est sensible aux impulsions laser et peut facilement être endommagée, provoquant la mort de l’embryon. Pour cette raison, la létalité de l’embryon après photoconversion peut être provoquée si la position du tissu cible est proche du corps vitellin.

5. Scannez l’échantillon à l’aide d’une pile z à l’aide de lasers pour 488 nm et 561 nm pour visualiser tout vert restant et la fluorescence rouge photoconvertie du PCFP.

Remarque 1 : Pour le balayage après photoconversion, nous avons utilisé un Plan Apochromat 20x/NA 0.8.

4. Retirer l’embryon de l’agarose

1. Jetez la solution et retirez soigneusement l’embryon de la LMA à 1 % à l’aide d’une aiguille ou d’une pointe en plastique lisse.
2. Maintenir l’embryon dans l’eau de l’œuf à l’obscurité à 28,5 °C jusqu’au stade de développement souhaité.

Note 1 : Il est important que les embryons poursuivent leur développement dans l’eau de l’œuf, en particulier pendant les premiers jours de développement lors de l’extension du corps embryonnaire. En effet, certains tissus/organes embryonnaires changent de position au cours du développement et nécessitent donc des orientations spécifiques lors de l’enrobage, qui dépendent du tissu/organe d’intérêt et du stade de développement souhaité de l’analyse.

5. Réintégration

1. Procédez comme au point 2.) du présent protocole.

6. Suivi du tissu photoconverti aux stades embryonnaires ultérieurs

1. Balayage de la région d’intérêt (z-Stack) à l’aide de lasers pour les signaux fluorescents verts et rouges de 488 nm et 561 nm, respectivement.

Remarque 1 : Pour le balayage x heures après la photoconversion, nous avons utilisé un Plan Apochromat 20x/NA 0.8.

Remarque 2 : Comme ce protocole n’affecte pas le développement normal de l’embryon, il est possible d’observer l’embryon photoconverti à des stades ultérieurs du développement (pour cela, procédez comme indiqué aux points 4 à 6).

7. Résultats représentatifs

Un exemple de test de photoconversion est illustré à la figure 1. Nous avons suivi les cellules endothéliales pendant le développement du poisson-zèbre (pour un examen de l’anatomie vasculaire du poisson-zèbre en développement, voir¹⁶). En conséquence, nous avons utilisé une ligne rapporteuse de poisson zèbre Tg(kdrl :nlsKikGR)^hsc7 exprimant KikGR dans les noyaux endothéliales¹⁷. Les embryons homozygotes et à expression vive ont été élevés à 28,5 °C jusqu’à 48 heures après la fécondation (hpf). Lors de la déchorionnation, les embryons ont été anesthésiés et intégrés dans le LMA en positionnant la face antéro-dorsale de l’embryon vers le verre de couverture pour une meilleure visualisation des vaisseaux de la tête. Nous utilisons un microscope confocal inversé (Zeiss LSM 710 Meta) équipé de lasers fonctionnant à 405 nm, 488 nm et 561 nm, et un objectif Plan Apochromat 20x/NA 0.8 pour le test de photoconversion et le suivi ultérieur de la protéine photoconvertie. Comme le montre la figure 1A, avant la photoconversion, KikGR était exprimé dans le tissu endothélial et n’était détectable que sous forme de fluorescence verte à l’aide d’un laser Argon de 488 nm. Les balayages de contrôle avec un laser DPSS 561-10 de 561 nm pour la fluorescence rouge n’ont détecté aucun KikGR photoconverti avant la photoconversion (Figure 1A). Par la suite, le retour d’intérêt a été entièrement photoconverti à l’aide d’un laser à diode de 405 nm (à une intensité de 10 %, 20 itérations) et les vaisseaux de tête ont été balayés à nouveau à l’aide des lasers de 488 nm et 561 nm (Figure 1B). Comme le montre la figure 1B, le vert KikGR est complètement passé au rouge dans le ROI. Après l’essai de photoconversion, l’embryon a été retiré de l’agarose et élevé à 28,5 °C dans de l’eau d’œuf. Enfin, l’embryon a été observé à nouveau 24 heures après la photoconversion, autour de 72 hpf, pour suivre les cellules endothéliales photoconverties aux stades ultérieurs (Figure 1C). Ainsi, l’embryon a été intégré dans le LMA, et l’échantillon a été re-scanné à l’aide des lasers de 488 nm et 561 nm. Comme le montre la figure 1C, dans le tissu endothélial résultant du ROI photoconverti, des protéines KikGR non et photoconverties ont été observées en raison de la stabilité du KikGR photoconverti en fluorescence rouge et de la resynthèse de nouveaux KikGR verts non photoconvertis.

Graphique 1. Photoconversion de KikGR pendant le développement du poisson-zèbre. (A,B) Une région spécifique de la vascularisation de la tête endothéliale a été photoconvertie à 48 hpf chez les embryons transgéniques Tg(kdrl :nlsKikGR)^hsc7 et (C) observée à nouveau 24 heures après la photoconversion (environ 72 hpf). La fluorescence de KikGR (vert), KikGR photoconverti (rouge) et les canaux fusionnés sont indiqués. Les cercles pointillés indiquent le retour sur investissement avant, après et 24 heures après la photoconversion. Les images sont des vues dorsales de l’embryon de poisson-zèbre, en avant du fond. Barres d’échelle : 50 μm.

Protéines (acronyme)	Ex (nm)	Em (nm)	Ce	Année précédente	Structure quaternaire	luminosité	application	ref
Kaede_G	508	518	99	0,9	tétramère	259	Suivi des cellules	2,6
Kaede_R	572	580	60	0,3	tétramère	59
KikGR_G	507	517	54	0,7	tétramère	112	Suivi des cellules	3,6,8-10
KikGR_R	583	593	35	0,6	tétramère	68
mKikGR_G	505	515	49	0,7	monomère	101	Suivi dynamique Images super-résolution	13
mKikGR_R	580	591	28	0,6	monomère	53
EosFP_G	506	516	72	0,7	tétramère	150	Suivi des cellules	5,20
EosFP_R	571	581	41	0,5	tétramère	67
tdEos_G	506	516	34	0,7	Dimère tandem	165	Images superrésolution	12,14,21
tdEos_R	569	581	33	0,6	Dimère tandem	59
mEos2_G	506	519	56	0,7	monomère	140	Suivi dynamique Images super-résolution	11,18
mEos2_R	573	584	46	0,7	monomère	90
Dendra2_G	490	507	45	0,5	monomère	67	Suivi dynamique Images super-résolution	4,11
Dendra2_R	553	573	35	0,55	monomère	57

Tableau I. Propriétés des protéines fluorescentes photoconvertibles. En plus du nom commun et/ou de l’acronyme de chaque PCFP, les longueurs d’onde d’excitation maximale (Ex) et d’émission (Em), les coefficients d’extinction molaire (EC, 10-3 M-1 cm-1), le rendement quantique (QY), la structure quaternaire physiologiquement pertinente, la luminosité relative (en % de l’EGFP), l’application et les références sont indiqués dans le tableau. Tableau adapté de Day et Davidson, 2010¹.

Le	Lignées transgéniques de poisson-zèbre	source
Kaede	Tg(elavl3 :Kaede)rw0130a	Laboratoire Okamoto
	Tg(EPV. TP1-MMU.Hbb :Kaede)
	Tg(ins :Kaede)
	Tg(isl1 :Gal4-VP16,14xUAS :Kaede)
	Tg(lhx5 :Kaede)b1204/+	ZIRC
	Tg(myl7 :kaede)
	Tg(olig2 :Kaede)
	Tg(UAS-E1b :Kaede)s1999t	ZIRC
	Tg(UAS :Kaede)rk8	ZIRC
	Tg(vsx2 :Kaede)nns2	Laboratoire Higashijima
KikGR	Tg(kdrl :nlsKikGR)
	Tg(krt4 :NTR-KikGR)
	Tg(myl7 :nlsKikGR)
	Tg(sox10 :KikGR)
	Tg(UAS :KikGR)
EosFP	Tg(sox10 :EosFP)
	Tg(sox10 :nlsEosFP)
Dendra	Tg(-8mpx :Dendra2)
	Tg(UAS :Dendra-kras)

Table II. Lignées transgéniques de poisson-zèbre exprimant PCFPs. Données obtenues dans la base de données des organismes modèles du poisson-zèbre (ZFIN, http://zfin.org/). La disponibilité des lignes dans le Centre International de Ressources sur le Poisson-Zèbre (ZIRC, http://zebrafish.org/zirc/) est indiquée.

Discussion

Ces dernières années, des modèles animaux transgéniques pour l’expression de protéines photoconvertibles telles que Kaede ou KikGR ont été générés. Ces animaux se développent normalement, ce qui indique que ces protéines n’ont pas d’effets toxiques sur le développement embryonnaire. Le premier rapport sur un test de photoconversion pour le suivi des cellules dans les embryons animaux a été réalisé par Hatta et ses collaborateurs par injection d’ARNm ou d’ADN codant pour Kaede dans des embryons de poisson-zèbre unicellula...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Matériaux :
Matériel nécessaire pour élever les poissons et collecter les œufs (voir le Zebrafish Book22 pour plus de détails).
Stéréomicroscope	Stéréomicroscope Leica	Lecia MZ6	Équipé d’un laser fonctionnant à 488 nm
Microscope confocal à balayage laser	Zeiss Zeiss	LSM 710 NLO	équipé de lasers fonctionnant à 488 nm, 561 nm et 405 nm
Bloc chauffant Paire
de pinces
Plat de culture à fond de verre	MatTek Corp		Ashland MA USA
Microloader Pipette Tips	Eppendorf
Vortex
needles
Reagents :
Egg water medium
60 &mu ; g/ml Sels de mer instantanés de l’océan en ddH2O
E3 moyen
5 mM NaCl
0,17 mM KCl
0,33 mM CaCl2
0,33 mM MgSO4
0,00001 % (p/v) Bleu de méthylène
4 mg/ml Solution mère de tricaïne
400 mg Tricaïne (acide 3-amino benzoïque)	Sigma-Aldrich
97,9 ml ddH2O
2,1 ml 1M Tris (pH9)
Ajuster au pH 7, aliquote et stocker -20 ° ; C
1 % LMA (Agarose à basse température de fusion, Lonza)
1g LMA/100 ml E3 medium 1X
Aliquote et stocker à 4 ° ; L