1 F O ATPase Vesicle Préparation et Technique for the Performing Patch enregistrements de serrage des membranes des vésicules submitochondriales

Résumé

Une méthode pour isoler les vésicules submitochondriales enrichis en F1FO ATP synthase complexes du cerveau de rat est décrite. Ces vésicules permettent l'étude de l'activité de F1FO complexe ATPase et sa modulation en utilisant la technique de l'enregistrement de patch-clamp.

Résumé

Les mitochondries sont impliquées dans de nombreuses fonctions cellulaires importantes, y compris le métabolisme, la survie à ^1, le développement et la signalisation calcium ^2. Deux des fonctions mitochondriales les plus importants sont liés à la production efficace de l'ATP, la devise de l'énergie de la cellule, par phosphorylation oxydative et la médiation des signaux de mort cellulaire programmée ^3.

L'enzyme principalement responsable de la production de l'ATP synthase est le F1FO-ATP, aussi appelé ATP synthase ^4-5. Au cours des dernières années, le rôle des mitochondries dans la mort cellulaire par apoptose et nécrose a reçu une attention considérable. Dans la mort cellulaire par apoptose, BCL-2 protéines de la famille tels que Bax entrent dans la membrane mitochondriale externe, s'oligomériser et perméabilisent la membrane externe, libérant des facteurs pro-apoptotiques dans le cytosol ^6. Dans la mort cellulaire nécrotique classique, telle que celle produite par une ischémie ou excitotoxicité des neurones, un large, augmentation mal régulé en calcium de la matrice contribue à l'ouverture d'un pore de la membrane intérieure, le pore de transition de perméabilité mitochondriale ou mPTP. Cette dépolarise la membrane interne et provoque des changements osmotiques, en contribuant à la rupture de la membrane externe, libération de facteurs pro-apoptotiques, et un dysfonctionnement métabolique. De nombreuses protéines dont la protéine Bcl-xL ⁷ interagir avec F1FO ATP synthase, de moduler sa fonction. Bcl-xL interagit directement avec la sous-unité bêta de l'ATP-synthase F1FO, et cette interaction diminue une conductance de fuite à l'intérieur de la F1FOATPasecomplex, augmentant le transport net de H + par F1FO pendant F1FO activité ATPase ⁸ et augmentant ainsi l'efficacité mitochondriale. Pour étudier l'activité et de la modulation de l'ATP synthase, nous avons isolé à partir de rongeurs cerveau submitochondriales vésicules (SMVS) contenant F1FO ATPase. Les SMVS conserver l'intégrité structurelle et fonctionnelle de la F1FO ATPase comme indiqué dans Alavian et al. Ici, nous décrivons une méthodeque nous avons utilisé avec succès pour l'isolement du SMVS de cerveau de rat et nous délimiter la technique de patch-clamp pour analyser l'activité du canal (ion fuite conductance) de la SMVS.

Protocole

1. Cerveau mitochondrial Isolation (Adapté de Brown MR et al. ⁹⁾

1. Sacrifier le rat en utilisant des méthodes approuvées par le Comité d'utilisation Institutional Animal Care et (IACUC).
2. Couper la tête de l'animal par décapitation, couper la peau et exposer le crâne.
3. Ouvrez le crâne doucement en coupant avec des ciseaux ou rongeur. Retirez le cerveau.
4. Hacher finement le cerveau sans cervelet dans le tampon d'isolement (voir tableau 1) et de le transférer à un ml en verre / téflon homogénéisation 5 (voir la liste de l'équipement).
5. Homogénéiser les tissus doucement 10 ....

Résultats

La première étape de notre protocole permet l'isolement des mitochondries purifiées comme indiqué par Western blot à la figure 1. Dans la figure 2 est représenté un exemple de submitochondriales enregistrement de patch des vésicules dérivé du cerveau. Utilisation de la configuration de patch inside-out, nous démontrons l'activité du canal modulé par l'ATP. Le contrôle (CTL) enregistrement (à gauche) montre l'activité du canal multi-conductance avec une conductance pic de 600 ch en moyen.......

Discussion

Les procédés décrits ici permettent l'isolement des mitochondries pur à la fin de l'étape 1 et des vésicules submitochondriales (SMVS) après l'étape 2 de cerveau entier, sans distinction de cellules phenotypes.SMVspurified par ce procédé sont essentiellement exempt de contamination par d'autres organelles sous-cellulaires comme indiqué dans Figure 1 et notre travail précédent (Alavian KN et al. ⁸⁾ et conserver leur intégrité structurale et fonctionnelle avant la congé.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Broyeur de tissus Potter-Elvehjem avec PTFEPestle	Krackeler Scientific, Inc.	1-7725T-5
Centrifugeuse Eppendorf 5424	Eppendorf	5424 000.410
4639 Cuve de rupture de cellule	Parr Instrument Company	4639
Ficoll	Sigma-Aldrich	F5415
Tubes à centrifuger en polycarbonate	Beckman Coulter	P20314
SW-50.1 rotor	Beckman Coulter
L8-70M Ultracentrifugeuse	Beckman Coulter
Digitonin	Sigma-Aldrich	D5628
Lubrol PX (C12E9)	Calbiochem	205534
Axopatch 200B	Axon Instruments
Digidata 1440A	Dispositif
pClamp10.0	Dispositif
Manipulateur	Sutter Instrument
Capillaire en verre borosilicaté	World Precision Instruments	1308325
Extracteur de micropipettes flamboyant/brun Modèle P-87	Sutter Instrument