Microgavage de larves de poisson zèbre

Résumé

Nous présentons une nouvelle méthode de gavage microscopique de larves de poisson-zèbre utilisant du matériel standard d'injection microscopique d'embryons et de microscopie stéréo. Nous démontrons que le gavage microscopique est une technique sûre et efficace, utile pour délivrer des quantités contrôlées de divers matériaux directement dans la lumière intestinale des larves de poisson-zèbre.

Résumé

Le poisson zèbre s'est imposé comme un organisme modèle puissant pour l'étude du développement intestinal^1-5, de la physiologie^6-11, des maladies^12-16 et des interactions hôte-microbe^17-25. Les approches expérimentales destinées à étudier la biologie intestinale nécessitent souvent l'introduction in vivo de matériaux sélectionnés dans la lumière de l'intestin. Dans le modèle du poisson zèbre larvaire, cela est généralement réalisé en plongeant les poissons dans une solution contenant le matériau choisi, ou par injection à travers la paroi abdominale. Lorsqu'on utilise la méthode d'immersion, il est difficile de surveiller ou de contrôler précisément la voie ou le moment de l'administration du matériau dans l'intestin. Pour cette raison, l'exposition par immersion peut provoquer une toxicité non voulue et d'autres effets sur les tissus extraintestinaux, limitant ainsi la gamme possible de quantités de matériau pouvant être délivrées dans l'intestin. De plus, la quantité de matériau ingérée pendant l'exposition par immersion peut varier considérablement d'une larve à l'autre²⁶. Bien que ces problèmes ne se posent pas lors d'une injection directe à travers la paroi abdominale, cette technique est délicate à réaliser et provoque des lésions tissulaires pouvant influencer les résultats expérimentaux. Nous présentons ici une méthode de microsondage chez les larves de poisson zèbre. L'objectif de cette méthode est de proposer un moyen sûr, efficace et reproductible de délivrer un matériau directement dans la lumière de l'intestin antérieur des larves de poisson zèbre, avec un contrôle précis du moment d'administration. Le microsondage utilise du matériel standard d'injection microscopique d'embryons et de stéréomicroscopie, couramment disponible dans la plupart des laboratoires travaillant sur le poisson zèbre. Une fois les poissons correctement positionnés dans la méthylcellulose, le sondage peut être effectué rapidement, à un rythme d'environ 7 à 10 poissons par minute, et le taux de survie après le sondage approche 100 %, selon la nature du matériau administré. Nous montrons également que le microsondage permet de charger la lumière intestinale avec des concentrations élevées de substances qui seraient létales pour les poissons en cas d'exposition par immersion. Afin d'illustrer l'utilité de cette méthode, nous décrivons un test de microsondage avec un dextran fluorescent, utilisable pour quantifier le passage du matériau depuis la lumière intestinale vers les espaces extraintestinaux. Ce test permet de vérifier l'exécution correcte de la procédure de microsondage, et fournit également un nouvel essai chez le poisson zèbre pour évaluer l'intégrité de la barrière épithéliale intestinale dans différentes conditions expérimentales (par exemple : manipulation génétique, traitement médicamenteux ou exposition à des facteurs environnementaux). En outre, nous montrons comment le sondage peut être utilisé pour évaluer la motilité intestinale en administrant des microsphères fluorescentes et en suivant leur transit ultérieur. Le microsondage peut être utilisé pour délivrer divers matériaux tels que des micro-organismes vivants, des facteurs ou toxines microbiens sécrétés, des agents pharmacologiques et des sondes physiologiques. Grâce à ces capacités, la méthode de microsondage chez les larves de poisson zèbre a le potentiel d'améliorer un large éventail de domaines de recherche utilisant ce système modèle.

Protocole

Nous utilisons des protocoles publiés pour l'élevage et le maintien standards du poisson zèbre afin d'obtenir des larves destinées à la microgavage²⁷. Nous utilisons principalement la reproduction naturelle pour multiplier les poissons, qui sont maintenus selon un cycle lumineux de 14 heures de lumière pour 10 heures d'obscurité. Ce protocole a été optimisé pour la microgavage de larves de poisson zèbre âgées de 6 à 7 jours post-fécondation (dpf). Nous prévoyons que ces méthodes seront généralement applicables à des stades développementaux plus jeunes et plus âgés avec de légères modifications. Sauf indication contraire, nous avons utilisé la souche sauvage....

Résultats

Lorsque la gavage est effectuée correctement, le matériel administré doit être entièrement contenu dans l'intestin antérieur, avec peu ou pas de résidu dans l'œsophage (Figure 3). Le volume administré doit être choisi de manière à pouvoir être contenu dans la bulle antérieure sans s'écouler par la cloaque ou l'œsophage. Si le volume de matériel ou la pression d'administration est trop élevé, la force physique du gavage peut endommager l'épithélium ou provoquer des fuites à travers celui-ci. Cela peut éga.......

Discussion

Dans ce travail, nous décrivons un nouveau protocole permettant l'administration directe de substances dans l'intestin de larves de poisson zèbre par microgavage. Plusieurs étapes critiques doivent être prises en compte tout au long de la procédure. Premièrement, les larves de poisson zèbre doivent être en bonne santé avant l'expérience de gavage afin d'éviter des décès non liés au traitement. Un autre facteur important est la qualité de l'aiguille de gavage. L'une des parties les plus délicates du protocole consiste à c.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Finquel (méthanesulfonate de tricaine)	Argent Chemical Laboratories	MS-222	Anesthésie des larves
Solution de rouge de phénol	Sigma-Aldrich	P0290-100 ml	0,5 % dans DPBS, testé pour la culture cellulaire
Huile minérale, claire, blanche (haute pureté)	Amresco	J217-500 ml	Pour le remplissage arrière des aiguilles et les tests de volume
Dextran marqué avec le Texas Red, poids moléculaire 10 000, fixable par la lysine	Invitrogen/ Molecular Probes	D-1863	Suspension à 1 % dans du PBS 1x/rouge de phénol
FM4-64FX	Invitrogen/ Molecular Probes	F34653	Solution mère à 5 mM dans l’eau
Méthylcellulose	MP Biochemicals	0215549590
Capillaires en verre borosilicaté	Drummond Scientific	3-000-203-G/X	Diamètre extérieur 1,14 mm, diamètre intérieur 0,53 mm, longueur 3,5 pouces
Embout en plastique pour la fabrication de moules	Adaptive Science Tools	TU-1
Unité de micro-injection Nanoject II	Drummond Scientific	3-000-204
Tire-lames Flaming Brown, filament large de 3,0 mm	Sutter Instrument Co.	P-97, FT330B	Préparation des aiguilles
Pince Dumont n°5 pour étudiants	Fine Science Tools	91150-20	0,1 x 0,06 mm, pour couper les aiguilles
Graticule oculaire, 5 mm - 100 divisions	Leica	10394771	Pour couper les aiguilles
Microforge	Narishige	MF-900	Coupe des aiguilles et polissage à la flamme
Aiguille pour seringue Tuberculin SlipTip	Becton Dickinson	309626	1 ml, aiguille 25G 5/8
Microsphères Fluoresbrite YG (2,0 μm)	Polysciences, Inc.	18338	Analyse de la motilité intestinale
Microscope stéréoscopique	Leica	S6E	Procédure de gavage
Microscope stéréoscopique à fluorescence	Leica	M205C	Essai de barrière au dextran
Microscope confocal	Zeiss	LSM510	Imagerie du dextran en circulation