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Article de méthode

Microgavage de larves de poisson zèbre

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DOI :

10.3791/4434

⸱

20 février 2013

 , 
1Department of Cell and Molecular Physiology, University of North Carolina at Chapel Hill

Dans cet article

Résumé

Nous présentons une nouvelle méthode de gavage microscopique de larves de poisson-zèbre utilisant du matériel standard d'injection microscopique d'embryons et de microscopie stéréo. Nous démontrons que le gavage microscopique est une technique sûre et efficace, utile pour délivrer des quantités contrôlées de divers matériaux directement dans la lumière intestinale des larves de poisson-zèbre.

Résumé

Le poisson zèbre s'est imposé comme un organisme modèle puissant pour l'étude du développement intestinal1-5, de la physiologie6-11, des maladies12-16 et des interactions hôte-microbe17-25. Les approches expérimentales destinées à étudier la biologie intestinale nécessitent souvent l'introduction in vivo de matériaux sélectionnés dans la lumière de l'intestin. Dans le modèle du poisson zèbre larvaire, cela est généralement réalisé en plongeant les poissons dans une solution contenant le matériau choisi, ou par injection à travers la paroi abdominale. Lorsqu'on utilise la méthode d'immersion, il est difficile de surveiller ou de contrôler précisément la voie ou le moment de l'administration du matériau dans l'intestin. Pour cette raison, l'exposition par immersion peut provoquer une toxicité non voulue et d'autres effets sur les tissus extraintestinaux, limitant ainsi la gamme possible de quantités de matériau pouvant être délivrées dans l'intestin. De plus, la quantité de matériau ingérée pendant l'exposition par immersion peut varier considérablement d'une larve à l'autre26. Bien que ces problèmes ne se posent pas lors d'une injection directe à travers la paroi abdominale, cette technique est délicate à réaliser et provoque des lésions tissulaires pouvant influencer les résultats expérimentaux. Nous présentons ici une méthode de microsondage chez les larves de poisson zèbre. L'objectif de cette méthode est de proposer un moyen sûr, efficace et reproductible de délivrer un matériau directement dans la lumière de l'intestin antérieur des larves de poisson zèbre, avec un contrôle précis du moment d'administration. Le microsondage utilise du matériel standard d'injection microscopique d'embryons et de stéréomicroscopie, couramment disponible dans la plupart des laboratoires travaillant sur le poisson zèbre. Une fois les poissons correctement positionnés dans la méthylcellulose, le sondage peut être effectué rapidement, à un rythme d'environ 7 à 10 poissons par minute, et le taux de survie après le sondage approche 100 %, selon la nature du matériau administré. Nous montrons également que le microsondage permet de charger la lumière intestinale avec des concentrations élevées de substances qui seraient létales pour les poissons en cas d'exposition par immersion. Afin d'illustrer l'utilité de cette méthode, nous décrivons un test de microsondage avec un dextran fluorescent, utilisable pour quantifier le passage du matériau depuis la lumière intestinale vers les espaces extraintestinaux. Ce test permet de vérifier l'exécution correcte de la procédure de microsondage, et fournit également un nouvel essai chez le poisson zèbre pour évaluer l'intégrité de la barrière épithéliale intestinale dans différentes conditions expérimentales (par exemple : manipulation génétique, traitement médicamenteux ou exposition à des facteurs environnementaux). En outre, nous montrons comment le sondage peut être utilisé pour évaluer la motilité intestinale en administrant des microsphères fluorescentes et en suivant leur transit ultérieur. Le microsondage peut être utilisé pour délivrer divers matériaux tels que des micro-organismes vivants, des facteurs ou toxines microbiens sécrétés, des agents pharmacologiques et des sondes physiologiques. Grâce à ces capacités, la méthode de microsondage chez les larves de poisson zèbre a le potentiel d'améliorer un large éventail de domaines de recherche utilisant ce système modèle.

Protocole

Nous utilisons des protocoles publiés pour l'élevage et le maintien standards du poisson zèbre afin d'obtenir des larves destinées à la microgavage27. Nous utilisons principalement la reproduction naturelle pour multiplier les poissons, qui sont maintenus selon un cycle lumineux de 14 heures de lumière pour 10 heures d'obscurité. Ce protocole a été optimisé pour la microgavage de larves de poisson zèbre âgées de 6 à 7 jours post-fécondation (dpf). Nous prévoyons que ces méthodes seront généralement applicables à des stades développementaux plus jeunes et plus âgés avec de légères modifications. Sauf indication contraire, nous avons utilisé la souche sauvage TL de poisson zèbre à 6 dpf, et les poissons n'ont pas été nourris. Toutes les expériences ont été réalisées dans de l'eau de système provenant de notre installation conventionnelle d'aquaculture de poissons zèbres ; toutefois, tout milieu approprié pour le poisson zèbre (par exemple milieu pour embryons ou milieu pour poisson zèbre gnotobiotique (GZM)28) peut être utilisé. Dans ce protocole, nous utilisons l'expression « milieu pour poisson zèbre » pour désigner le milieu choisi par l'utilisateur.

1. Préparation de la méthylcellulose, du moule pour gavage et fabrication de l'aiguille de microgavage

La veille ou le matin du jour de l'expérience, préparez la méthylcellulose, le moule en agarose pour la stabilisation des larves et les microcannules pour le gavage.

  1. Dissoudre 3 g de méthylcellulose dans 100 ml d'eau stérile désionisée ou dans du milieu pour poisson zèbre (selon l'application) afin d'obtenir une solution à 3 %. Ajouter une barre magnétique dans le flacon, chauffer l'eau à une température proche de l'ébullition, puis placer sur un agitateur magnétique à haute vitesse. Pendant l'agitation, saupoudrer lentement la méthylcellulose afin d'éviter la formation d'agrégats. Réduire progressivement la vitesse d'agitation et la température de l'agitateur au cours de la journée jusqu'à atteindre la température ambiante.
  2. Poursuivre une agitation lente pendant la nuit jusqu'à dissolution complète de la méthylcellulose. La solution peut être conservée à température ambiante pendant plusieurs mois dans un récipient hermétiquement fermé.
  3. Préparer un moule en gélose à 3 % dans une boîte de Pétri de 10 cm à l'aide d'un moule en plastique (Adaptive Science Tools, TU-1), conformément aux instructions du fabricant. Sceller avec du parafilm et conserver à 4 °C jusqu'à utilisation afin d'éviter la dessiccation. Réchauffer à température ambiante ou à 28 °C avant l'expérience. Les moules en agarose peuvent généralement être réutilisés plusieurs fois.
  4. Étirer plusieurs aiguilles de gavage à partir de capillaires en verre borosilicaté, à l'aide d'un étireur de micropipettes Flaming Brown équipé d'un filament chauffant à large cuvette (FT330B). Les programmes que nous utilisons pour la fabrication des aiguilles sont les suivants :
Type d'aiguillePressionChaleurTractionVélocitéTemps
embryon50031510050200
gavage50031512575200

Étant donné que les filaments peuvent varier selon les instruments, enregistrez le temps de rampe (durée de chauffage active). Notre temps de rampe varie entre 8,57 et 8,79 ms pour ce programme. Ce programme produit des aiguilles plus courtes et plus épaisses que les aiguilles utilisées en microinjection traditionnelle (Figure 1). Ces paramètres peuvent nécessiter une optimisation selon les différents tireurs de micropipettes.

2. Coupe, chargement et étalonnage des aiguilles de microgavage

Remarque* : Le rognage de l'aiguille est une étape cruciale de ce protocole. De plus, les méthodes de chargement et d'étalonnage des aiguilles varieront selon le type d'unité de microinjection utilisée. Nous avons optimisé ce protocole à l'aide de microinjecteurs Drummond II, mais nous prévoyons qu'il sera également applicable à d'autres instruments de microinjection moyennant de légères modifications. Étant donné que les dispositifs d'injection et les tireuses d'aiguilles peuvent varier d'un laboratoire à l'autre, il sera important de mesurer/étalonner les volumes d'injection (voir la section 2.8).

  1. Les aiguilles sont coupées sous un stéréomicroscope. Nous utilisons un stéréomicroscope Leica S6E réglé à un grossissement de 2,5x. À ce réglage, notre réticule oculaire comportant 100 divisions mesure 2 mm de longueur.
  2. Alignez la pointe de l’aiguille avec l’extrémité de la règle du réticule (graduation 100) et coupez l’aiguille à l’aide de pinces de précision à pointe fine, à environ 1 mm de la pointe (graduation 48-50) (Figure 1A).
  3. L’aiguille doit avoir un diamètre d’environ 27-30 μm et être émoussée. Examinez les extrémités des aiguilles à un grossissement de 100x. Les aiguilles pointues ou irrégulières augmentent la probabilité de dommages pendant la gavage et doivent être évitées si possible.
  4. Alternativement, lorsqu’il est disponible, un micro-foret peut être utilisé pour mieux contrôler le point de coupe de l’aiguille et polir ses extrémités au chalumeau afin d’éliminer les bords tranchants (Figure 1B).
  5. Préparez la solution de gavage. Pour la plupart des applications, nous préparons la solution en ajoutant une dilution 1:10 d’une solution de rouge de phénol à 0,5 % dans du tampon salin phosphate de Dulbecco (DPBS) (Sigma-Aldrich), afin de rendre la solution visible au stéréomicroscope pour vérifier le bon fonctionnement du microinjecteur et le positionnement de la solution de gavage dans le bulbe antérieur. D'autres colorants de charge que le rouge de phénol n'ont pas été évalués mais pourraient être utilisés.
  6. Préparez l’aiguille de gavage en la remplissant d’huile minérale à l’aide d’une seringue de 1 ml munie d’une aiguille 25G 5/8. Montez-la sur l’unité de microinjection Nanoject II.
  7. Recouvrez d’un film parafilm une boîte de Pétri en plastique de 10 cm afin d’obtenir une surface plane et imperméable, puis déposez environ 2 μl de la solution de gavage sur le parafilm. Remplissez manuellement l’aiguille de gavage en veillant à éviter la formation de bulles d’air dans l’huile minérale.
  8. Pour tester le fonctionnement du microinjecteur et calibrer le volume éjecté, remplissez une boîte de Pétri de 3 cm avec de l’huile minérale et effectuez des injections dans l’huile jusqu’à obtenir des gouttelettes de taille constante. Mesurez le diamètre des gouttelettes à l’aide du réticule ou d’une fonction de mesure du stéréomicroscope, si disponible. Calculez le volume des gouttelettes (Équation : V=4/3πr3). La constance du volume entre les aiguilles est représentée graphiquement (Figure 1C).
  9. Rincez la pointe de l’aiguille par immersions répétées dans du milieu pour zebrafish propre afin d’éliminer l’huile minérale résiduelle avant de commencer la gavage. L’huile minérale est très dense et pourrait endommager les tissus épithéliaux si elle n’est pas retirée de la pointe de l’aiguille.

3. Anesthésie, montage et gavage de larves de poisson zèbre

  1. Chauffer le moule en agarose à température ambiante ou à 28 °C avant l'expérience.
  2. Préparer le moule en agarose pour la gavage en recouvrant 3 rainures avec de la méthylcellulose à 3 %. Utiliser une quantité suffisante de méthylcellulose pour couvrir les rainures et maintenir les poissons, sans toutefois en mettre si peu qu'elle s'assèche rapidement.
  3. Dans une plaque de 6 puits propre, répartir les larves de zebrafish de chaque groupe expérimental dans des puits séparés, chacun contenant 3,5 à 4,0 ml de milieu pour zebrafish.
  4. Préparer une solution de tricaïne 3x (0,05 % p/v) dans le milieu approprié pour zebrafish. Anesthésier les poissons un puits à la fois en mélangeant un volume égal de tricaïne 3x au puits contenant les larves, afin d'obtenir une concentration finale de 1,5x (0,025 %), puis agiter doucement.
  5. Dès que les zebrafish cessent de bouger, les retirer du puits à l’aide d’une pipette Pasteur en verre à large orifice et d’un pompeur, puis les placer un par un sur la méthylcellulose, la tête positionnée selon l’angle de 45° de la rainure et la queue dirigée vers l’angle de 90°. Appuyer délicatement sur les poissons avec une sonde de dissection émoussée pour stabiliser leur position.
  6. Régler le dispositif de microinjection Nanoject II de sorte que l’aiguille soit inclinée selon un angle faible, approximativement parallèle à l’angle de 45° du moule en agarose. S’assurer que la course de l’aiguille est suffisante pour atteindre le fond du puits du moule, afin de limiter les ajustements une fois les poissons en place.
  7. Régler l’unité de microinjection pour délivrer 4,6 nl (maximum) en mode injection lente (23 nl/sec). À ces réglages, le volume délivré doit juste remplir la bulbe intestinal antérieur sans s’écouler par l’œsophage ou la cloaque. Des volumes inférieurs peuvent être utilisés selon les objectifs de l’expérience.
  8. Utiliser une main pour effectuer de légers ajustements de la plaque contenant les larves immobilisées tout en contrôlant simultanément, de l’autre main, le manipulateur de l’unité de microinjection.
  9. Introduire délicatement l’aiguille de gavage dans la bouche du poisson anesthésié, la faire passer par l’œsophage, puis relâcher légèrement le sphincter œsophagien afin de positionner la pointe de l’aiguille juste à l’intérieur du bulbe intestinal antérieur (Figure 2, étape 1-2, a&b).
  10. Une fois l’aiguille à l’intérieur du bulbe antérieur, appuyer doucement sur la pédale ou le bouton d’injection pour administrer le produit. Retirer ensuite l’aiguille rapidement et en douceur, en veillant à ne pas libérer une quantité significative de produit dans l’œsophage (Figure 2, étape 3-4).
  11. Après le gavage, utiliser une pipette Pasteur en verre à large orifice et un pompeur pour déplacer délicatement les larves de zebrafish vers un milieu frais. Remplir la pipette d’eau jusqu’à environ 2,5 cm au-dessus du coude, créer une petite poche d’eau dans la méthylcellulose près de la tête de la larve pour la libérer, soulever doucement la tête dans l’embout de la pipette, puis aspirer la larve hors de la méthylcellulose. Expulser délicatement le poisson et toute l’eau de la pipette dans une boîte contenant du milieu frais.
  12. Rincer les larves dans du milieu frais en les aspirant et en les rejetant doucement plusieurs fois ou en les aspergeant de milieu afin d’éliminer la méthylcellulose et de réveiller les larves de l’anesthésie. Transférer les larves dans une boîte de Pétri ou une plaque de 6 puits jusqu’à leur utilisation pour les analyses et imageries ultérieures.

4. Dosage du dextran pour évaluer la sécurité de la gavage et l'intégrité de la barrière intestinale

La microgavage peut être utilisée pour délivrer divers matériaux dans l'intestin. À titre d'exemple, nous fournissons ci-dessous un protocole pour le gavage d'une dextrane de 10 kD conjuguée au Texas Red afin d'analyser l'intégrité de la barrière de l'épithélium intestinal. Au moins deux voies potentielles de perméabilité paracellulaire existent, présentant des différences de sélectivité selon la charge et la taille des solutés, appelées voies « pore » ou « fuite »29. Étant donné que cette dextrane est trop grande pour être absorbée à travers l'épithélium intestinal par la voie paracellulaire « pore » (limite de taille ~4Å, dextrane de 10 kD = ~23Å)9,30-32, elle devrait rester dans la lumière intestinale si l'intégrité de la barrière intestinale n'est pas compromise. Bien qu'une dextrane de 10 kD puisse être transportée via la voie paracellulaire « fuite », cette voie présente une capacité plus faible et une cinétique plus lente29,33, et n'est donc pas susceptible de se produire dans le délai de cet essai. Un traitement « témoin positif » destiné à perturber l'intégrité de la barrière est réalisé par l'ajout d'EDTA, qui perturbe les jonctions serrées épithéliales34,35. Cet essai de gavage à la dextrane peut servir de test de contrôle qualité pour démontrer que la procédure de gavage est effectuée de manière sûre, sans dommage tissulaire involontaire. De plus, cet essai peut être utilisé pour évaluer l'intégrité de la barrière intestinale en fonction du génotype ou d'un traitement donné.

  1. Préparer les solutions de gavage suivantes : 1 % de dextrane / 1x PBS / 0,05 % de rouge de phénol et 1 % de dextrane / 20 mM EDTA / 1x PBS / 0,05 % de rouge de phénol (témoin positif). Le stock de dextrane à 5 % dans de l’eau ddH2O est conservé en aliquots de 50 μl à -20 °C afin de réduire le nombre de cycles de congélation-décongélation. Préparer également une solution de gavage témoin contenant 1x PBS / 0,05 % de rouge de phénol.
    + témoin (EDTA)pas d'EDTA
 stockfinalfacteur de dilution10 μl10 μl
EDTA, pH 8200 mM20 mM1010
Dextran5 %1 %522
PBS10x1x1011
Phenol Red0,50 %0,05 %1011
   sous-total :54
   ddH2O :56
   Total :1010
  1. Utilisez le protocole de la section 3 pour administrer par gavage des groupes de 10 à 20 larves de poisson zèbre pour chaque condition expérimentale. Répétez cette opération sur des groupes en double ou en triple, si possible.
  2. Après le gavage, sortez les larves de l’anesthésie et laissez-les nager librement dans un milieu frais.
  3. À 18-20 min post-gavage, ré-anesthésiez les larves comme indiqué à l’étape 3.3. Placez les larves dans de la méthylcellulose à 3 % sur un bloc d’agarose à 3 % (ceci réduit les reflets parasites pendant l’imagerie).
  4. Imagez les larves à l’aide d’un stéréomicroscope à fluorescence (par exemple, Leica M205C) équipé d’un jeu de filtres Texas Red, avec un grossissement permettant d’afficher les larves depuis le museau jusqu’immédiatement en arrière de l’extrémité de la cloaque.
  5. Acquérez toutes les images avec les mêmes réglages d’exposition afin de pouvoir les quantifier et les comparer ultérieurement. La fluorescence sera intense dans la lumière intestinale de toutes les larves injectées avec du dextran, mais la fonction de barrière est évaluée par le niveau de dextran apparaissant dans les tissus extraintestinaux (c’est-à-dire, le tronc et les vaisseaux sanguins) (Figure 5). Ajustez l’exposition à des valeurs permettant de visualiser la fluorescence du tronc, même si cela surexpose la fluorescence de la lumière.
  6. Décalez les horaires de gavage de sorte que chaque groupe passe approximativement le même temps de récupération après le gavage et soit imagé au même moment approximatif post-gavage. Pour cette expérience, chaque groupe prend environ 1 heure à une personne pour être traité. Les poissons sont anesthésiés à 18-20 min post-gavage, et l’imagerie prend environ 1 à 2 minutes par poisson.
  7. Utilisez un logiciel d’analyse d’image tel qu’ImageJ pour quantifier l’intensité moyenne relative de fluorescence dans une région du tronc située juste au-dessus de l’intestin. Normalisez ces valeurs en soustrayant une mesure de fond effectuée dans une région de l’image située en dehors du poisson.
  8. Représentez graphiquement et analysez les données issues de l’analyse d’image à l’aide de GraphPad Prism ou d’un logiciel statistique similaire.

5. Dosage par microsphères fluorescentes pour évaluer la motilité intestinale

La gavage permet un meilleur contrôle du moment et de la quantité de produit délivré dans l'intestin, ce qui en fait une méthode alternative idéale pour les études de la motilité intestinale. Les techniques publiées précédemment pour mesurer la motilité intestinale chez les larves de poisson zèbre incluent l'observation directe des contractions et des ondes intestinales par microscopie1,21,36, ou l'alimentation des larves avec de la nourriture mélangée à des microbilles polystyrènes fluorescentes jaune-vert26. Dans certaines études, la quantification des profils de motilité intestinale a été améliorée en plongeant les larves dans un milieu contenant un colorant alimentaire37 ou en utilisant une technique spécialisée d'analyse vidéo appelée cartographie spatiotemporelle38,39. Ici, nous présentons une étude de principe démontrant qu'il est possible d'administrer par gavage des microbilles fluorescentes dans la bulbe intestinale antérieure, et que le suivi du déplacement des microbilles peut être utilisé pour évaluer la motilité intestinale (Figure 6). La principale différence entre cette méthode et l'approche de Field et collaborateurs26 réside dans le fait que les billes sont introduites seules et ne peuvent pas être incorporées à la nourriture en raison des limites du diamètre de l'aiguille de gavage.

  1. Conserver les larves de poisson zèbre dans des boîtes de 10 cm contenant 35 ml de milieu jusqu’au moment de l’expérience, réalisée à 7 dpf. Commencer à nourrir les larves une fois par jour le matin à partir de 5 dpf avec environ 0,6 mg de nourriture en poudre (régime pour larves, tel que décrit précédemment40 ; administré à l’aide d’une boucle d’inoculation stérile de 1 mm).
  2. Agiter doucement le flacon de microbilles polystyrènes Fluoresbrite YG de 2,0 μm (~2,5 % de suspension aqueuse) afin d’homogénéiser la suspension. Prélever une goutte du flacon sur du parafilm pour pouvoir mesurer un volume précis à l’aide d’une pipette.
  3. Dans un tube Eppendorf, centrifuger les billes à faible vitesse dans une microcentrifugeuse de banc, éliminer le surnageant, puis le remplacer par du PBS 1x au volume initial. Répéter cette opération afin de laver les microbilles deux fois.
  4. Préparer une suspension d’alimentation contenant 0,25 % de microbilles (dilution 1:10 de la suspension mère) dans du PBS 1x et 0,05 % de rouge de phénol. Chaque larve reçoit un volume d’alimentation de 4,6 nl contenant environ 2,6x103 microbilles.
  5. Utiliser le protocole de la section 3 pour réaliser l’alimentation par sonde du nombre souhaité de larves. Les microbilles sont légèrement flottantes ; par conséquent, l’alimentation doit être effectuée aussi rapidement que possible afin de maximiser l’uniformité de la suspension.
  6. Dans cette expérience, 15 larves ont été alimentées par sonde puis conservées individuellement dans les puits d’une plaque de 12 puits après récupération de l’anesthésie, afin de suivre le transit chez des individus. Toutefois, des groupes plus importants peuvent également être alimentés par sonde et le transit peut être évalué au niveau de la population plutôt qu’individuellement. Se référer à Field et al. pour les pratiques standard26.
  7. Évaluer la motilité intestinale en notant la position la plus rostrale (ou antérieure) des microbilles fluorescentes chez les larves vivantes à différents moments à l’aide d’un stéréomicroscope à fluorescence. Anesthésier brièvement les larves dans du tricaine 1x (0,017 %), puis noter les zones de localisation des microbilles ou capturer des images pour analyse ultérieure.
  8. Tracer et comparer le pourcentage de larves total présentant des microbilles dans une région intestinale donnée en fonction du temps.

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Résultats

Lorsque la gavage est effectuée correctement, le matériel administré doit être entièrement contenu dans l'intestin antérieur, avec peu ou pas de résidu dans l'œsophage (Figure 3). Le volume administré doit être choisi de manière à pouvoir être contenu dans la bulle antérieure sans s'écouler par la cloaque ou l'œsophage. Si le volume de matériel ou la pression d'administration est trop élevé, la force physique du gavage peut endommager l'épithélium ou provoquer des fuites à travers celui-ci. Cela peut éga...

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Discussion

Dans ce travail, nous décrivons un nouveau protocole permettant l'administration directe de substances dans l'intestin de larves de poisson zèbre par microgavage. Plusieurs étapes critiques doivent être prises en compte tout au long de la procédure. Premièrement, les larves de poisson zèbre doivent être en bonne santé avant l'expérience de gavage afin d'éviter des décès non liés au traitement. Un autre facteur important est la qualité de l'aiguille de gavage. L'une des parties les plus délicates du protocole consiste à c...

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Déclarations de divulgation

Aucun conflit d'intérêts déclaré.

Remerciements

Nous remercions les membres du laboratoire Rawls pour leurs suggestions utiles sur le contenu, ainsi que le Dr Alan Fanning pour ses discussions précieuses sur la perméabilité en fonction de la taille des jonctions serrées et les méthodes de perturbation. Nous remercions également le Dr Michael Chua et le Dr Neal Kramarcy de la Michael Hooker Microscopy Facility pour leur soutien concernant le microscope confocal. Ce travail a été financé par des subventions des National Institutes of Health : T32 DK007737-15 (boursier J.L.C.), F32 DK094592 (attribuée à J.L.C.) et R01 DK081426 (attribuée à J.F.R.).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Finquel (méthanesulfonate de tricaine)Argent Chemical LaboratoriesMS-222Anesthésie des larves
Solution de rouge de phénolSigma-AldrichP0290-100 ml0,5 % dans DPBS, testé pour la culture cellulaire
Huile minérale, claire, blanche (haute pureté)AmrescoJ217-500 mlPour le remplissage arrière des aiguilles et les tests de volume
Dextran marqué avec le Texas Red, poids moléculaire 10 000, fixable par la lysineInvitrogen/ Molecular ProbesD-1863Suspension à 1 % dans du PBS 1x/rouge de phénol
FM4-64FXInvitrogen/ Molecular ProbesF34653Solution mère à 5 mM dans l’eau
MéthylcelluloseMP Biochemicals0215549590
Capillaires en verre borosilicatéDrummond Scientific3-000-203-G/XDiamètre extérieur 1,14 mm, diamètre intérieur 0,53 mm, longueur 3,5 pouces
Embout en plastique pour la fabrication de moulesAdaptive Science ToolsTU-1
Unité de micro-injection Nanoject IIDrummond Scientific3-000-204
Tire-lames Flaming Brown, filament large de 3,0 mmSutter Instrument Co.P-97, FT330BPréparation des aiguilles
Pince Dumont n°5 pour étudiantsFine Science Tools91150-200,1 x 0,06 mm, pour couper les aiguilles
Graticule oculaire, 5 mm - 100 divisionsLeica10394771Pour couper les aiguilles
MicroforgeNarishigeMF-900Coupe des aiguilles et polissage à la flamme
Aiguille pour seringue Tuberculin SlipTipBecton Dickinson3096261 ml, aiguille 25G 5/8
Microsphères Fluoresbrite YG (2,0 μm)Polysciences, Inc.18338Analyse de la motilité intestinale
Microscope stéréoscopiqueLeicaS6EProcédure de gavage
Microscope stéréoscopique à fluorescenceLeicaM205CEssai de barrière au dextran
Microscope confocalZeissLSM510Imagerie du dextran en circulation

Références

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