Capture d'sélectif de 5-hydroxyméthylcytosine partir de l'ADN génomique

Résumé

Décrit un procédé de marquage en deux étapes à l'aide β-glucosyltransférase (β-GT) pour transférer un azide-glucose à 5-HMC, suivie par click chemistry pour transférer un segment de liaison de biotine pour l'enrichissement facile et indépendante de la densité. Cette méthode d'étiquetage efficace et spécifique permet l'enrichissement de la 5-HMC avec un fond extrêmement faible et la cartographie épigénomique à haut débit via séquençage de prochaine génération.

Résumé

5-méthylcytosine (5-mC) constitue ~ 2-8% des cytosines total dans l'ADN génomique humain et affecte une large gamme de fonctions biologiques, y compris l'expression des gènes, le maintien de l'intégrité du génome, empreinte parentale, inactivation du chromosome X, la réglementation des développement, le vieillissement et le cancer ^1. Récemment, la présence d'un 5-mC oxydé, 5-hydroxyméthylcytosine (5-HMC), a été découvert dans les cellules de mammifères, en particulier dans les cellules souches embryonnaires (ES) et de cellules neuronales ^2-4. 5-HMC est généré par l'oxydation du 5-mC catalysée par TET famille du fer (II) / α-cétoglutarate en fonction de dioxygénases ^{2, 3.} 5-HMC est proposé de participer à l'entretien de souches embryonnaires (MES) cellulaire, hématopoïèse normale et les tumeurs malignes et le développement du zygote ^{2, 5-10.} Afin de mieux comprendre la fonction de la 5-HMC, un système de séquençage fiable et simple est essentielle. Séquençage bisulfite traditionnelle ne peut pas distinguer 5-5-console HMC à partir MC ¹¹ 12.

Nous décrivons ici une simple procédure en deux étapes pour l'étiquetage chimique sélective de la 5-HMC. Dans la première étape de marquage, le 5-HMC dans l'ADN génomique est marqué avec un azide catalysée 6-β-glucose par-GT, une glucosyltransférase du bactériophage T4, d'une manière qui transfère le 6-azide-glucose à 5-HMC de l' modifié cofacteur, UDP-6-N3-Glc (6-N3UDPG). Dans l'étape, biotinylation seconde, une liaison disulfure biotine est fixé au groupe azide par click chemistry. Ces deux étapes sont très spécifiques et efficace, conduisant à compléter l'étiquetage quelle que soit l'abondance de la 5-HMC dans des régions génomiques et en donnant de fond extrêmement faible. Après biotinylation de 5-HMC, les fragments d'ADN 5-HMC contenant sont ensuite sélectivement capturéen utilisant des billes de streptavidine d'une manière indépendante de la densité. Les résultantes 5-HMC-enrichis fragments d'ADN peuvent être utilisés pour les analyses en aval, y compris séquençage de prochaine génération.

Notre marquage sélectif et le protocole de capture confère une sensibilité élevée, applicable à toute source d'ADN génomique avec des variables / 5 diversifiée HMC abondance. Bien que le but principal de ce protocole est son application en aval (., Séquençage de prochaine génération de cartographier la distribution 5-HMC dans le génome), il est compatible avec une seule molécule, en temps réel SMRT (ADN) séquençage, qui est capable de fournir séquençage résolution d'une seule base de 5-HMC.

Protocole

1. La fragmentation ADN génomique

Fragment d'ADN génomique en utilisant sonication à une gamme de taille souhaitée adapté à la plate-forme de séquençage du génome entier. (En général, nous soniquer à ~ 300 pb.) Vérifier la distribution de la taille de l'ADN génomique fragmenté sur gel d'agarose 1% (Figure 1).

2. Préparation de l'ADN

Déterminer les quantités d'ADN à partir basées sur l'abondance de la 5-HMC dans l'ADN génomique. Depuis le 5-HMC niveaux varient considérablement dans différents types de tissus, des quantités d'ADN à partir ....

Discussion

5-hydroxyméthylcytosine (5-HMC) est une modification présente récemment identifié épigénétique en quantités importantes dans certains types de cellules de mammifères. La méthode présentée ici est de déterminer la distribution du génome entier de 5-HMC. Nous utilisons bactériophage T4 β-glucosyltransférase de transférer une fraction de glucose ouvragée contenant un groupe azide sur le groupe hydroxyle de 5-HMC. Le groupe azide peut être modifié chimiquement avec de la biotine pour la détection, l'enrichissement d'.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Nom	Entreprise	Catalogue	Commenter
			Réactifs
Le chlorure de sodium 5M (NaCl)	Promega	V4221
0,5 M pH 8,0 acide éthylène diamine (EDTA)	Promega	V4231
1M Trizma de base (Tris) pH 7,5	Invitrogen	15567-027)
HEPES 1M, pH 7,4	Invitrogen	15630
Le chlorure de magnésium (MgCl 2) 1M	Ambion	AM9530G
Diméthylsulfoxyde (DMSO)	Sigma	D8418
Tween 20	Fisher BioReagents	BP337-100
DBCO-SS-biotine conjugué Peg3-	Cliquez sur Outils Chimie	A112P3
1,4-dithiothréitol, ultrapure (TNT) suprapur	Invitrogen	15508-013
QIAquick suppression de nucléotides	Qiagen	28304
Micro Bio-Spin 6 Colonne	Bio-Rad	732-6222
Dynabeads MyOne	Invitrogen	650-01
Streptavidine C1
Qiagen PCR Purification Kit MinElute	Qiagen	28004
UltraPure Agarose	Invitrogen	16500500
UDP-6-N 3-glucose	Active Motif	55013
			Enzyme
β-glucosyltransférase (β-GT)	New England Biolab	M0357
			Équipement
Dispositif de sonication	Covaris
Centrifugeuse bureau
Bain d'eau	Fisher Scientific
Appareil de gel running	Bio-Rad
NanoDrop1000	Thermo Scientific
Labquake Tube Shaker	Barnstead
Labquake Tube Shaker	Thermolyne
Pied de séparation magnétique	Promega	Z5342
Qubit 2,0 fluorimètre	Invitrogen
			10 Configuration réactif X β-GT tampon de réaction (500 mM HEPES pH 7,9, 250 mM de MgCl 2) 2 X à relier et de lavage (B & W) tampon (10 mM Tris pH 7,5, EDTA 1 mM, NaCl 2 M, 0,02% de Tween 20) .