Enrichissement de série de souches et des cellules progénitrices des spermatogonies (SSC) dans la culture de dérivation de long terme Lines adultes CSE de souris

Laura A. Martin; Marco Seandel

doi:10.3791/50017

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Article de méthode

Enrichissement de série de souches et des cellules progénitrices des spermatogonies (SSC) dans la culture de dérivation de long terme Lines adultes CSE de souris

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DOI :

10.3791/50017

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25 février 2013

Laura A. Martin¹ , Marco Seandel¹

¹Department of Surgery, Weill Cornell Medical College

Dans cet article

Résumé

Une méthode simple pour obtenir et maintenir la tige spermatogonies et des lignées de cellules souches de souris adultes est présenté ici. La méthode utilise des cellules nourricières en provenance du compartiment des cellules somatiques du testicule de souris adultes. Cette technique est applicable à des souches de souris communes, y compris transgénique, knock-out, et souris knock-in.

Résumé

Spermatogonies souches et des cellules progénitrices (CSP) du testicule représentent un exemple classique de cellules souches adultes de mammifères et préserver la fertilité de près la vie de l'animal. Bien que les mécanismes précis qui régissent l'auto-renouvellement et la différenciation in vivo sont difficiles à l'étude, différents systèmes ont été développés précédemment pour propager SSC murins in vitro en utilisant une combinaison de milieux de culture spécialisées et cellules nourricières ^1-3.

Dans la plupart des incursions in vitro sur la biologie des SSC ont dérivé des lignées de cellules de nouveau-nés, probablement en raison de la difficulté d'obtenir des lignées de cellules adultes ^4. Toutefois, le testicule continue d'évoluer jusqu'à environ 5 semaines d'âge dans la plupart des souches de souris. Au début des années période post-natale, des changements dramatiques se produisent dans l'architecture du testicule et de la biologie à la fois somatique et les cellules spermatiques, y compris les changements dans les niveaux d'expression de cellules souches multiples liésgènes. Par conséquent, la période néonatale lignées dérivées de CSE ne peut pas totalement récapituler la biologie des SSC adultes qui persistent après le testicule adulte a atteint un état d'équilibre.

Plusieurs facteurs ont entravé la production de lignées de CSE adultes historiquement. Tout d'abord, la proportion de cellules souches fonctionnelles peuvent diminuer pendant l'âge adulte, soit en raison de facteurs intrinsèques ou extrinsèques ^5,6. En outre, comme avec d'autres cellules souches adultes, il a été difficile pour enrichir SSC suffisamment partir de cellules adultes au total des testicules sans l'aide d'une combinaison de stratégies de tri immunosélection ou autres ^7. Stratégies couramment utilisées comprennent l'utilisation de souris cryptorchides comme source de cellules du donneur en raison d'un ratio plus élevé de cellules souches à d'autres types cellulaires ^8. Sur la base de l'hypothèse que l'élimination des cellules somatiques de la culture initiale perturbe les interactions avec la niche de cellules souches qui sont essentiels pour la survie SSC, nous avons déjà développé des méthodes pour calculer l adulteines qui ne nécessitent pas immunosélection ou des donateurs cryptorchides mais plutôt employer l'enrichissement de série des SSC de la culture, ci-après dénommés SESC ^2,3.

La méthode décrite ci-dessous implique une procédure simple pour dériver adultes lignes SSC en dissociant l'adulte donneur de tubes séminifères, suivie par dépôt de cellules sur les départs constitués d'une ligne de cellules stromales testiculaire (JK1) ^3. Grâce passage en série, fortement adhérent, contaminant les cellules non germinales sont dépourvues de la culture à l'enrichissement concomitant des SSC. Cultures produites de cette manière contiennent un mélange de spermatogonies à différents stades de différenciation, qui contiennent des SSC, basée sur le long terme la capacité d'auto-renouvellement. Le point crucial de la méthode SESC est qu'il permet SSC pour rendre le passage difficile de l'auto-renouvellement in vivo à long terme d'auto-renouvellement in vitro dans un micro-environnement radicalement différent, produit à long terme des lignes SSC, libre de contaminationcellules somatiques, et permet ainsi une manipulation expérimentale subséquente des SSC.

Protocole

1. Préparation de cellules nourricières

Notez que tous les réactifs décrits ci-dessous doivent être préparés de manière stérile (voir les tableaux 1 et 2). Ce protocole utilise la lignée cellulaire JK1 (Cell Biolabs, Inc, catalogue # ABC-315) que les mangeoires qui est un dérivé de transformer des cellules adultes de souris somatiques testiculaires et a été décrit ailleurs ^3. Notez également que toutes les procédures sur les animaux doit être effectuée conformément aux directives et règlements institutionnels.

JK1 cellules peuvent être maintenues en culture et utilisées avec succès comme dispositifs d'alimentation à passage 39. Culture JK1 cellules dans une boîte de 100 mm de culture cellulaire (BD Falcon, catalogue n ° 353003) avec 10 ml de milieu de croissance d'alimentation stérilisée par filtration (DMEM supplémenté avec 10% de sérum bovin foetal [FBS], 2 mM de L-glutamine et des antibiotiques). Lorsque la culture atteint la confluence de 95%, divisez les cellules 1:06 -1:10 rapport.
Éliminer le milieu de confluence JK1 mono cellules nourricièrescouche.
Laver couche de cellules une fois avec du PBS sans calcium ni magnésium.
Ajouter préchauffé trypsine / EDTA, 1x (0,05% trypsin/0.53 mM d'EDTA; Cellgro Corning, catalogue n ° 25-051-CI), et incuber à 37 ° C pendant 5-10 min.
Inactiver la trypsine avec un volume égal de milieu de croissance chargeur. Recueillir des cellules et centrifuger à 300 xg pendant 5 min. Remettre en suspension les cellules dans un milieu de croissance chargeur.
Pré-manteau plaques multi-puits culture cellulaire en ajoutant suffisamment de 0,4% solution de gélatine pour couvrir le puits et retirer au bout de 5 min à température ambiante.
Plaque ~ 250 cellules par mm ² de gélatine revêtu plaque de culture cellulaire (par exemple le format 48-puits ou 6-puits). Incuber la culture à 37 ° C pendant 16 à 24 heures.
Retirer milieu de culture à partir de puits. ATTENTION: Pour désactiver la croissance des cellules, ajouter une nouvelle solution de mitomycine C à 10 pg / ml dilué dans du DMEM à chaque puits (par exemple, 200 pl / puits d'une plaque de 48 puits). Mitomycine C est toxique. Manipulez et jetez-le avec soin. Incuber à37 ° C pendant 4 h.
Retirer la mitomycine C solution de cellules. Laver 3 fois avec du DMEM avant des cellules souches de placage.
Retirer du DMEM à partir de cellules nourricières puits et ajouter suffisamment de support de cellules souches (100 pl / puits d'une plaque 48 puits, voir le tableau 3) pour éviter la dessiccation des mangeoires au cours de passages. Ajouter SSC Le même jour, tel que décrit ci-dessous dans les sections 3.1 ou 3.4, avec des tailles indiquées de puits contenant des mangeoires.

2. Dissociation de la souris testicule tissu pour obtenir des cellules germinales des bailleurs de fonds

Testicules de souris adultes récolte de façon stérile et stocker temporairement les testicules dans un plat recouvert de Petri (sans ajout de liquide). Le plat doit immédiatement placé sur la glace pour empêcher la dessication et de maintenir la viabilité des cellules.
En utilisant une pince fine stériles et un ciseau bien dans une hotte de culture cellulaire, faire une incision transversale dans la tunique albuginée sans complètement sectionnant le testicule (c.-à-cut ~ ½ - ¾ à distance through) et utiliser une pince pour faire sortir les tubes séminifères dans un coin de la plaque; tunique de défausse et tissus ci-joint. Gardez la plaque sur la glace tout au long de garder les tissus réfrigérés, et sauvegardent ainsi leur intégrité et prévenir l'évaporation.
Rapidement émincer tubules avec des ciseaux à ressort fines au moins 3 min par les testicules, tout en gardant la plaque sur la glace.
Ramassez les fragments de tubules dans un tube conique de 50 ml et laver à ~ 40 ml de sérum de veau glacée PBS / 1% d'albumine.
Centrifuger à 60 g pendant 10 minutes pour séparer les fragments de tubules de spermatozoïdes et de débris. Rejeter le surnageant.
Dans un tube de 15 ml conique, remettre en suspension le culot dans 3 ml par de testicule préchauffé tampon de dissociation (DMEM, la trypsine 0,05%, 0,03% collagénase de type I, 80% d'U / ml de DNAse I et la sérum albumine bovine 0,5; Voir Tableau 2 pour des détails plus spécifiques de tampon de dissociation).
Placer le tube conique horizontalement dans un support en un ensemble agitateur à 150 tours par minute à 37 ° C pendant 15 min afin de maximiser unegitation.
Centrifuger à 60 g pendant 10 minutes pour séparer les cellules individuelles de morceaux non dissociées.
Enregistrer les morceaux culot contenant jusqu'à l'étape suivante. Recueillir le surnageant de l'étape 2.8 et ajouter 3 ml DMEM/10% de sérum de veau foetal à neutraliser tampon de dissociation. Placer le tube sur la glace temporairement.
Répétez l'étape 2,6 à 2,7 avec le culot de l'étape sauvé 2,9 à re-digérer les morceaux restants après l'étape 2.8.
Ajouter un volume égal de DMEM/10% de FBS pour neutraliser tampon de dissociation.
Suspension de l'étape recombinent avec suspension cellulaire 2,11 sauvegardé à l'étape 2.9. Centrifuger pendant 5 min à 300 x g.
Resuspendre le culot dans un milieu de cellules souches dans un volume de 16 ml par paire de testicules (voir le tableau 3).

3. Placage de suspension de cellules testiculaires

Planche 2 ml de suspension cellulaire par puits dans des cellules de 6 puits plaque d'alimentation contenant mitotiquement-inactivé par la mitomycine C et placer dans un incubateur de culture cellulaire à 37 ans ° C dans 5% de CO _2.
Après 48 heures, moyen aspiration, ajouter 2 ml de milieu frais et revenir à l'incubateur.
Après 48 heures, on ajoute 0,5 ml de milieu frais de cellules souches dans chaque puits et retourner à l'incubateur.
Après 48 heures, puis nourrir les cellules trois fois par semaine par la suite jusqu'à ce que suit grandes colonies discrètes (> 50 cellules) semble (dans les 7 à 21 jours). Pour la première et la deuxième nourrir chaque semaine (par exemple le lundi et le mercredi) supprimer ~ 50% de la moyenne et rajouter 50% en volume de milieu frais. Pour l'alimentation du tiers (par exemple vendredi), aspirer tout moyen et remplacez-le par 2 ml de milieu frais. Cette approche est basée sur l'idée que l'évitement des changements de milieu complet minimise les fluctuations dans les concentrations de signaux paracrines qui sont sécrétées dans le milieu ^de culture ^9.

4. Cueillette colonie de Premier Passage

Retirer moyen de puits contenant des colonies à être repiquées et ajouter du milieu frais sur les cellules souches.
Identifier les colonies en utilisant un objectif 10x. Avec le microscope légèrement défocalisé, les colonies SSC au bord du puits apparaît comme homogènes amas brillants, composées de nombreuses cellules 11-12 pm de diamètre, dans laquelle il est difficile, voire impossible, de discerner les bordures des cellules individuelles, puisque les cellules apparaissent fusionnés (figure 1A). Non-SSC colonies peuvent apparaître plus foncées, plus granulaire, ou moins homogène, avec des frontières discernables (figure 1A, en médaillon).
En utilisant une pointe de pipette 200 ul, avec l'ensemble pipetteman à 50 pi, tout d'abord prendre moyennes du puits et expulser pour mouiller la pointe. Ensuite, pousser gentiment la colonie avec la pointe avant de retirer rapidement 50 ul de milieu de déloger la colonie par aspiration dans la pointe (figure 1B).
Expulser le milieu contenant la colonie dans un puits d'une plaque à 48 puits contenant des cellules nourricières inactivées avec 100 ul de milieu de cellules souches (figure 1C).
Répétez l'étape4.3 et ajouter jusqu'à 8 colonies au même puits sans excéder 500 pi par puits.
Répétez les étapes 4,3 à 4,5 pour préparer d'autres puits de la plaque de 48 puits avec des colonies de passage SSC un.
Wells sera prêt à diviser en 7-14 jours ou après de grosses touffes de jusqu'à 500 cellules ont vu le jour (figure 1D).

5. L'expansion ultérieure et repiquage des SSC par trituration

Cellules à passage ne doit être repiquée sur mangeoires frais après un maximum de 14 jours à un rapport de division de 1:2 pour les 3 premiers passages, puis 01 heures 04-01:06 (tous les 7 jours) par la suite comme suit. Doucement triturer colonies hors d'un puits semi-confluente (par exemple ~ 300.000 SSC / puits de 6-puits) avec une pointe de pipette 1 ml de milieu de lavage à travers les cellules. Les colonies peuvent être vus se détacher. Trop de force avec le courant de liquide pourrait causer des cellules nourricières indésirables à se détacher aussi.
Recueillir des cellules triturées dans un tube conique et centrifuger à 300 xg pendant5 min. Remarque: Une étape trypsination peuvent être ajoutés en toute sécurité ici si désiré par l'investigateur.
Aspirer le surnageant et remettre en suspension dans un milieu de cellules souches frais en fond de pipetage de haut en bas de perturber les colonies.
SSC plaque sur des cellules nourricières inactivées fraîchement préparés avec de la mitomycine-C, comme décrit dans la section 1.
Nourrir les cellules trois fois par semaine comme suit. Pour l'alimentation premier et le deuxième (par exemple le lundi et le mercredi) ajouter 50% en volume de milieu frais. Pour l'alimentation du tiers (par exemple vendredi), aspirer tout moyen et remplacez-le par 2 ml de milieu frais. Plaques deviendra confluente dans les 7-10 jours. Les cultures doivent être composé de cellules germinales> 98% (c.-à <1% contaminants cellules somatiques) après des passages 5-7, basé sur immunomarquage (par exemple en utilisant la souris sur les cellules germinales marqueur GCNA) pour distinguer les cellules germinales à partir de cellules somatiques ^10. Remarque: Ces méthodes ont été développées dans le respect des règlements et des exigences fixées par l'institutionprotection des animaux et le Comité al utilisation au Weill Cornell Medical College.