C. elegans Chemotaxis Assay

Résumé

Procédé d'évaluation quantitative de la réponse chimiotactique des Caenorhabditis elegans Est décrite. Un indice chimiotactique (CI) a été utilisé comme un moyen d'évaluer précisément la réponse des vers de terre pour certaines cibles, et de servir de plate-forme de comparaison entre les souches et les composés d'intérêt.

Résumé

De nombreux organismes utiliser chemotaxis à rechercher des sources de nourriture, éviter les substances nocives, et trouver des partenaires. Caenorhabditis elegans a un comportement de chimiotactisme impressionnant.

La prémisse de tester la réponse des vers à une substance odorante est de les placer dans une zone et observer le mouvement évoquée en réponse à une substance odorante. Même avec les nombreux tests disponibles, l'optimisation ver lieu de départ par rapport à la fois le contrôle et d'essai, tout en minimisant l'interaction du virus avec l'autre, tout en conservant une taille importante de l'échantillon reste un travail en cours ^1-10. La méthode décrite ici a pour but de remédier à ces problèmes en modifiant le dosage développée par Bargmann et al. ^1. Une boîte de Pétri est divisé en quatre quadrants, deux quadrants opposés marqués "Test" et deux sont désignés "Control". Anesthésique est placé dans tous les essais et les sites témoins. Les vers sont placés au centre de la plaque avec une Circle marquée autour de l'origine de veiller à ce que les vers non mobiles seront ignorés. Utilisant un système à quatre quadrants plutôt que 2 ou deux 1 élimine biais dans le mouvement des vers, car ils sont à égale distance à partir d'échantillons de test et de contrôle, quel que soit le côté de l'origine, ils ont commencé. Cela évite le problème de vers peuvent être contraints de voyager à travers un ensemble d'autres vers de terre pour répondre à une substance odorante, ce qui peut retarder les vers ou les forcer à prendre une voie plus détournée, ce qui donne une interprétation erronée de leur trajectoire prévue. Cette méthode présente également des avantages pratiques en ayant une taille d'échantillon plus large et permettant au chercheur d'exécuter le test sans surveillance et marquer les vers une fois le temps imparti est écoulé.

Introduction

Ward abord développé le test de chimiotactisme en 1973 ^5, et depuis lors il a eu des applications de grande envergure. Neurobiologie est un domaine qui a bénéficié de l'aide d'une variété d'essais de chimiotaxie. Adaptation olfactive, une forme simple d'apprentissage et la mémoire, a été démontrée dans C. elegans utilisant des dosages de chimiotaxie ^6. Ils ont également été utilisés pour montrer que C. elegans peuvent développer l'éthanol tolérance un résultat qui démontre non seulement la plasticité comportementale des vers, mais qui montre aussi que les vers peuvent être très utiles dans l'étude de la ....

Protocole

1. Préparation / laver les Worms

1. Synchroniser vers de jeune adulte ^11.
2. Pipette 2 ml de la Basal S sur une plaque de Chemotaxis de 5 cm de scène vers qui viennent défrichées la pelouse du OP50 E. coli. Inclinaison de la plaque en fonction des besoins pour assurer les vers sont lavées à partir de la surface de la plaque dans la mémoire tampon.
3. Pipette 1 ml de la solution Basal ver-S dans un tube de centrifugation.
4. Centrifuger pendant 10 secondes à l'aide d'un PicoFuge à 6600 rpm.
5. Aspirer le Basal S, laissant le culot de vers non perturbées.
6. Ajouter 1 ml solution Basal S au tube de ....

Résultats

Comparaison de type sauvage (N2) C. elegans à l'ODR-10 (KY10) mutant.

Nous avons utilisé le diacétyle, un C. connu elegans chimiotactique et de comparer les vers de type sauvage à celui d'un mutant qui manque le récepteur de diacétyle ^1,12. Par type sauvage (N2) vers l'index chimiotactique était 0,100 ± 0,066 pour l'éthanol et 0,839 ± 0,031 à 0,5% diacétyle. Comme prévu, le diacétyle provoque une réponse chimioattractives i.......

Discussion

Chemotaxis, bien que contrôlé par un ensemble complexe de mécanismes neuronaux et cellulaire, peut être facilement et objectivement quantifiée en utilisant des dosages de chimiotaxie. Pour obtenir les meilleurs résultats des tests, certaines étapes cruciales doivent être prises. Tout d'abord, la mise en scène des vers est essentiel à donner des résultats expérimentaux cohérents. Worms à différents stades de la vie comportent différemment ^13; vers la scène de manière mixte peut fausser les résultats expéri.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
S Basal (- cholesterol) [5.8 g NaCl; 1 M K phosphate buffer, pH 6.0; dH2O à 1 litre.] Autoclave
PicoFuge	Stratagene	400552
Microscopes	Leica
Dissecting	Leica
P1000 Pipette	Gilson
P10 Pipette	Gilson
0.5 M Sodium Azide
Agar de chémotaxie [1,6% d'agar BBL (Benton-Dickinson) ou 2% d'agar Difco. Autoclave. Ajouter 5 mM de phosphate de potassium, pH 6,0; 1 mM CaCl2, 1 mM MgSO4]
Ethanol/Eau distillée
Composants de test (par exemple 0,5% de diacetyl)
Agar	Bio-Rad	166-0600
NH4Cl	Amresco	CA97062-046
MOPS	VWR	CA12001-120
NH4OH	BDH	CABDH8641-2
0.25% Tween 20	Bio-Rad	170-6531