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Article de méthode

Les analyses en temps réel des Transports rétinol par le récepteur membranaire de plasma Retinol Binding Protein

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DOI :

10.3791/50169

⸱

28 janvier 2013

 ,  , 
1Department of Physiology, Jules Stein Eye Institute and Howard Hughes Medical Institute, University of California, Los Angeles

Dans cet article

Résumé

Nous décrivons ici une technique optimisée pour produire de haute qualité complexe de la vitamine A / RBP et deux techniques de surveillance en temps réel pour étudier le transport de la vitamine A par STRA6, le récepteur de la RBP.

Résumé

La vitamine A est essentielle pour la vision et l'. Croissance / différenciation de presque tous les organes de l'homme Plasma retinol binding protein (RBP) est le principe et le transporteur spécifique de vitamine A dans le sang. Nous décrivons ici une technique optimisée pour produire et purifier holo-RBP et deux techniques de surveillance en temps réel pour étudier le transport de la vitamine A par le récepteur de haute affinité RBP STRA6. La première technique permet de produire une grande quantité de haute qualité holo-RBP (100%-chargé avec rétinol) pour la vitamine A des dosages de transport. RBP haute qualité est essentielle pour les tests fonctionnels, car mal repliées RBP communiqués de vitamine A contamination bactérienne facilement et en préparation RBP peut causer des artefacts. Techniques de surveillance en temps réel, comme l'électrophysiologie ont apporté des contributions essentielles aux études de transport membranaire. La RBP médiée par le récepteur de transport du rétinol n'a pas été analysé en temps réel jusqu'à récemment. La seconde technique décrite ici est la raisonl analyse en temps STRA6 catalysée par la libération de rétinol ou le chargement. La troisième technique est analyse en temps réel de STRA6 catalysée par le transport du rétinol à partir holo-RBP au cellulaire retinol binding protein I (CRBP-I). Ces techniques offrent une sensibilité et une résolution élevées en révélant récepteur de la vitamine RBP Un mécanisme de captation.

Introduction

La vitamine A est une molécule organique qui est essentiel à la survie et au bon fonctionnement de presque tous les organes de l'homme. Dérivés de vitamine A (rétinoïdes) participer à divers événements biochimiques et cellulaires, y compris la détection de la lumière pour 1,2 vision et la régulation de l'expression des gènes et la traduction des protéines au cours du développement embryonnaire et dans les tissus adultes 3-6. Bien que le rétinol est capable de diffuser par voie systémique, l'évolution a proposé plasma protéine de liaison du rétinol, une protéine de support spécifique pour le transport de la vitamine A dans le sang d'atteindre une efficacité et une spécificité élevées et pour éviter la toxicité associée à la diffusion aléatoire 7-10. Un récepteur de haute affinité qui se lie à RBP et prend de la vitamine A a été imaginé dans les années 1970, 11-13. Malgré les preuves accumulées depuis trois décennies sur l'existence du récepteur RBP 14-31, l'hypothèse du récepteur a été débattue pendant de nombreuses années en raison de l'existence d'une définition incorrecte des holo-RBP. La définition correcte des holo-RBP est que c'est la grande affinité complexe 1:1 entre le rétinol et la RBP. L'extraction répétée de holo-RBP par un solvant organique est nécessaire pour produire apo-RBP. Cette définition est utilisée par presque tous les laboratoires qui étudient RBP 7,9,32-35 ou le récepteur RBP 14-31,36-42. La définition incorrecte des holo-RBP qui a servi à réfuter l'existence du récepteur RBP est le mélange aiguë de libre rétinol-RBP avec apo. Puisque la fonction du récepteur de la vitamine A dans les RBP absorption de holo-RBP est de libérer le rétinol-RBP de holo, le récepteur RBP ne jouerait aucun rôle dans l'absorption du rétinol si rétinol est libre de commencer (comme proposé par la définition erronée du holo -RBP).

La récente identification du récepteur RBP comme un domaine protéique appelé multitransmembrane STRA636 et sa fonction dans l'absorption de la vitamine A à partir de holo-RBP 36-43 milite fortement contre l'hypothèse que les pratiques commerciales restrictives nebesoin d'un récepteur pour fournir des analyses de vitamine A. détaillée a révélé que STRA6 9 domaines transmembranaires avec l'extrémité N-terminale extracellulaire situés et C-terminaux situés intracellulaire 40. Situé entre transmembranaire 6 et 7 est un domaine essentiel RBP contraignant 39. STRA6 est couplé à la fois LRAT et CRBP-je en vitamine A à partir de l'absorption holo-RBP, mais ni LRAT ni CRBP-I est absolument nécessaire pour une meilleure STRA6 activité 41. STRA6 capacité à catalyser la libération de rétinol-RBP holo est la clé de son activité de vitamine A 41 l'absorption. En s'appuyant sur STRA6 pour libérer son rétinol, vitamine A par RBP peut transporter la vitamine A pour cibler les cellules dans les tissus périphériques avec une spécificité et une efficacité élevées.

L'importance cruciale de holo-RBP définition et la préparation est illustrée non seulement par le débat historique sur l'existence du récepteur RBP, mais aussi par trois associés travaux récents sur holo-RBP définitions difrents de la définition originale et correcte 44-46. Le premier document utilisé la définition holo-RBP qui a été utilisé pour désapprouver l'existence du récepteur RBP pour étudier le récepteur RBP 44. Les deuxième et troisième venu avec une troisième définition de holo-RBP qui rend encore moins probable que le rétinol à étudier pour former un complexe avec bon RBP 45,46. Ces études préparées en mélangeant 3 H-retinol/RBP holo-RBP (même pas apo-RBP) avec 3 H-rétinol. Depuis ce test n'a pas 3 H-retinol/RBP formé et ne retirez pas excessive gratuitement 3 H-rétinol 45,46, ce n'est pas un essai de 3 H-rétinol absorption de 3 H-retinol/RBP, mais est un logiciel gratuit 3 test de diffusion H-rétinol. Il a été montré précédemment que STRA6 ne favorise pas l'absorption cellulaire du rétinol libre par LRAT 38 ou CRBP-I 41. La quasi-totalité rétinol est lié à des pratiques commerciales restrictives dans le sang et il n'y a pas détectable fréquencee rétinol. Une fonction principale du récepteur RBP est de catalyser la libération de rétinol-RBP holo pendant la prise de rétinol-RBP holo 41. Si le rétinol est artificiellement liberté provisoire ou sous forme libre pour commencer 45,46, le récepteur RBP n'est pas nécessaire. Les résultats radicalement différents obtenus à partir du dosage du rétinol libre diffusion par rapport aux tests basés sur correctement préparés holo-RBP illustrer le fait que la préparation correcte de la RBP est crucial pour ses tests fonctionnels.

RBP peut être purifiée à partir de sérum humain 41, mais la procédure est complexe et le rendement est faible. Une autre approche consiste à produire des RBP dans E. coli. Parce E. coli n'a pas la capacité de plier correctement mammifères protéines sécrétées avec plus d'une paire de liaisons disulfures comme RBP, il est essentiel de replier RBP et purifier la protéine correctement repliée. Protéines mal repliées non seulement se comportent différemment des RBP plié corrigé dans divers dosages,mais aussi provoquer l'agrégation des protéines au cours du stockage. Pour la même raison, l'apo-RBP est seulement produit de haute qualité holo-RBP. Nous décrivons ici un protocole optimisé pour produire des RBP haute qualité 100% chargé avec le rétinol par l'expression bactérienne, repliement et purification par HPLC. Purification par HPLC élimine non seulement les pratiques commerciales restrictives mal repliées, mais aussi importante contamination bactérienne qui peut causer des artefacts graves si RBP est utilisé dans des essais de transduction du signal. Nous avons également décrire deux techniques sensibles de surveillance en temps réel pour étudier le transport du rétinol par STRA6. Les deux techniques dépendent de la RBP de haute qualité. Faute d'espace, les techniques classiques de la vitamine rétinoïde basée sur HPLC et basée sur des tests radioactifs A absorption ne sont pas décrites ici.

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Protocole

1. Production, repliement et purification par HPLC de Holo-RBP

  1. Transformer BL-21cells avec le vecteur pET3a hébergeant l'ADNc humain pour RBP avec 6x His tag sur le N-terminal. Cultivez les transformées BL-21 cellules dans un shaker à 37 ° C dans 40 ml de milieu LB carbénicilline jusqu'à ce que la DO à 600 nm atteigne 0,5. Induire l'expression de la protéine RBP par addition d'IPTG 1 mM d'. Croître les bactéries à 37 ° C un autre 5 heures.
  2. RBP produite dans E. coli est surtout présente dans les corps d'inclusion insolubles. Pour enrichir corps d'inclusion, les cellules à granules à 10.000 xg pendant 20 min. Puis sonication des cellules sur de la glace dans 5 ml de PBS avec des inhibiteurs de protéase, suivis de 2 cycles de gel et dégel. Pellet bas les corps d'inclusion à 20.000 xg pendant 30 min à 4 ° C. Retirer le surnageant et le culot garder sur la glace.
  3. Solubiliser le culot de corps d'inclusion par sonication dans 10 ml de chlorhydrate 7,5 M de guanidine. Ajouter un demi-volume (5 ml) de tampon Tris 25 mM, pH 9,0 et DTT à une finale concentration de 10 mM. Mélanger vigoureusement solution sur un vortex nuit à température ambiante pour réduire complètement et dénaturer les protéines.
  4. Centrifuger la solution de protéines pour éliminer les matières insolubles à 18.000 xg pendant 20 min à 4 ° C. Après le spin, transférer le surnageant dans un nouveau tube et placer le tube sur la glace.
  5. Préparer quatre volumes (60 ml) de tampon de repliement (25 mM Tris, pH 9,0, 0,3 mM cystine, la cystéine mM 3,0, EDTA 1 mM). Dégazer le tampon de repliement. Également préparer 600 pl 10 mM dans l'éthanol rétinol sous une lumière rouge sombre. Gardez-le dans l'obscurité sur la glace. Tant le tampon de repliement et la solution de rétinol doivent être fraîchement préparées.
  6. Refroidir à la fois la solution de protéine et le tampon de repliement sur de la glace pendant au moins 30 min. Une température plus élevée réduit probablement la qualité des RBP replié. Ajouter 1 ml de tampon de repliement goutte à goutte et 10 ul de solution de rétinol à son tour, tandis que la solution de protéine est vigoureusement mélangé dans un bécher sur la glace. Répétez cette étape jusqu'à ce que tous tampon de repliement et le rétinolsont ajoutés. Gardez en remuant la réaction sur la glace dans l'obscurité pendant 5 heures.
  7. Isoler la réaction de repliement à 24.000 xg pendant 30 min à 4 ° C. Il est essentiel d'éliminer les agrégats juste après la réaction de repliement.
  8. Concentrer la solution surnageante en utilisant concentrateur Amicon Ultra 15 (MWCO 10 K) à environ 10 ml. Ne vous concentrez pas la solution replié de plus de ce niveau. Concentrer trop mènera à l'agrégation des protéines et diminue le rendement et la qualité finale de la RBP correctement repliée. Diluer l'échantillon concentré avec du PBS froid à 100 ml. Le but de cette étape est d'éliminer les composants de la réaction de repliement qui interfèrent avec la purification du nickel.
  9. Faites tourner la solution une fois de plus à 24.000 xg pendant 20 min à 4 ° C. Il est important d'enlever tout précipité. Transférer le surnageant à deux tubes de 50 ml contenant chacun 1 ml de Ni-NTA boue qui a été lavées avec du PBS. Faire tourner les tubes à 4 ° C pendant une heure. Incubation f solution diluéeou 1 h peut provoquer la précipitation de protéines mal repliées qui doivent être enlevés.
  10. Centrifuger les tubes à 500 xg pendant 3 min. Retirer le surnageant avec précaution. Flottant quelque chose doit être retiré. Ajouter du PBS froid à 30 ml pour chaque tube. Faites tourner à nouveau et retirer le surnageant. Répétez ce processus jusqu'à ce que vous ne voyez rien, mais perles dans le tube.
  11. Transférer la résine Ni-NTA à une colonne vide. Laver la résine avec 20 volumes de colonne de 10 mM d'imidazole, NaCl 500 mM dans du PBS. Son éluer-RBP en 5 volumes de colonne de 100 mM d'imidazole dans du PBS. Ne pas stocker cette solution pendant une période de temps prolongée, et de congélation réduit le rendement et la qualité finale. Pour un meilleur résultat, purifier RBP par HPLC immédiatement.
  12. Son Dialyser-RBP purifiée à partir de la résine Ni-NTA contre 25 mM de Tris, pH 8,4, et NaCl 120 mM. Un concentrateur peut également être utilisé pour l'échange de tampon. Échantillons clairs pour HPLC par centrifugation à 16.000 xg pendant 10 min à 4 ° C juste avant chaque course.
  13. Purifier holo-RBP sur HPLC en utilisant un ioncolonne échangeuse d'AX-300 par un gradient de NaCl étape (220 mM 12 min, 360 mM 15 min, et 1.000 mM 15 min) en utilisant 25 mM de Tris, pH 8,4 comme phase mobile à 1 ml / min. Avec l'augmentation de la concentration de NaCl, holo-His-RBP est relâché alors que l'apo-RBP RBP et mal repliées rester liée à la colonne (Figure 1). Si repliement RBP ne se fait pas de manière optimale, mal repliées RBP (par exemple mal repliées RBP-I dans la figure 1) peuvent prédominer toute la préparation.
  14. Récupérer le correctement repliée holo-RBP des fractions du pic à 360 mM de NaCl. Surveiller attentivement le profil d'élution correctement repliées et mal repliées Sa-RBP. À 1.000 mM de NaCl, la plupart des mal repliées Sa-RBP devrait être libéré.
  15. Les fractions contenant holo-RBP sont rassemblées, concentrées et dialysées contre PBS pendant une nuit à 4 ° C. Vérifiez le rendement et la qualité finale (330 nm/280 nm) par spectrophotomètre. Produit correctement repliée devrait avoir un ratio de 330 nm/280 nm légèrement supérieur à 1 (figure 1).
  16. Pour la productione apo-RBP, ajouter un volume égal d'heptane purifié à l'holo-RBP et mélanger doucement en tournant une nuit à 4 ° C. Centrifuger à 16000 g pendant 10 min à 4 ° C et transférer soigneusement la phase aqueuse inférieure à un nouveau tube (en évitant le précipité à l'interface). Répétez le processus trois fois avec une incubation de 3 h pour chacun. Vérifiez absorption sur un spectrophotomètre Nanodrop pour s'assurer que le pic de 330 nm a diminué au niveau de fond.

2. Surveillance en temps réel de STRA6-catalysée de parution rétinol et le rétinol Chargement en cours

  1. Bloquer un noir 96 puits Microfluor-2 plaque (Thermo Scientific) avec 200 pi de caséine Blocker (Pierce) pendant une nuit à 4 ° C afin d'éviter le collage non spécifique des holo-RBP au plastique. Bloqueur de caséine donne le meilleur effet de blocage des toutes les solutions de blocage que nous avons testés.
  2. Membranes fraîchement préparés à partir de cellules exprimant STRA6 ou des cellules de contrôle sont lavées avec du PBS et passé à travers une seringue Hamilton (Gastipo ds # 1710) 6 fois pour produire une suspension uniforme dans du PBS. On utilise généralement des membranes provenant de 1/100-1/20 de cellules cultivées sur un plat 100 mm par réaction.
  3. Laver les puits revêtus de la plaque Microfluor-2 une fois avec 200 ul de PBS. Refroidir la plaque sur la glace avant l'addition de la suspension de membrane (50 pi par puits).
  4. Surveillance en temps réel de rétinol fluorescence est mesurée à l'aide de l'optique de fluorescence Omega PolarStar (BMG Labtech) avec le 320EX excitation et le filtre d'émission 460-10. Le programme est réglé sur le mode de lecture Endpoint. Le mode Plaque peut également être utilisé pour mesurer une évolution dans le temps si les intervalles de temps ne sont pas modifiées. Le signal provenant de chaque point de temps est la moyenne de 10 mesures (calcul de la moyenne orbital d'un diamètre de 2 mm) et le gain est fixé à 1.800. La plaque est agitée pendant 10 secondes à 500 tours par minute à l'aide de double agitation orbitale avant chaque mesure.
  5. Pour démarrer le test de libération de rétinol, les puits sont lues une fois en utilisant la lecture Endpoint mode avant holo-RBP (généralement une concentration de 1 uM final) est ajouté à 0 min. Dès que holo-RBP est ajouté, la réaction est contrôlée en permanence toutes les 5-10 minutes pendant 1-3 h. Pour démarrer le test de chargement rétinol tout-trans rétinol (typiquement de 1 uM de concentration finale) est ajouté aux puits sous une lumière rouge sombre. La plaque est lue une fois avant l'apo-RBP est ajouté à 0 min. Dès que l'apo-RBP est ajouté, la réaction est contrôlée en permanence toutes les 5-10 minutes pendant 1-3 h.
  6. Après toutes les mesures sont effectuées, télécharger les données brutes (exemple de la figure 2) à partir du logiciel Omega analyse des données (BMG Labtech) vers Microsoft Excel pour l'analyse des données. Chaque point dans le temps génère un fichier qui contient les lectures de toutes les conditions expérimentales. Par exemple, s'il ya 20 points dans le temps, de consolider les 20 dossiers en un seul fichier Excel pour l'analyse des données.
  7. Pour l'analyse des données, les signaux de fluorescence avant l'addition de rétinol ou holo-RBP à 0 min sont considérées comme un bruit de fondd soustrait des signaux de fluorescence finale à tous les points dans le temps. Bien que les signaux de fond sont faibles par rapport au rétinol fluorescence en holo-RBP, soustraction du fond élimine l'influence non spécifique de diffusion de la lumière par les membranes et permet de se concentrer sur la fluorescence de rétinol-RBP holo ou rétinol ajouté à 0 min.

3. Surveillance en temps réel de STRA6 catalysée par Transports de rétinol-RBP De Holo à CRBP-I

  1. Rétinol-EGFP est un transfert de nouvelle résonance de fluorescence (FRET) paire qui a récemment été mis en place 41. STRA6 catalysée par le transport du rétinol à partir holo-RBP pour EGFP-CRBP-I est suivie en temps réel en mesurant le rétinol-EGFP FRET. Protéine de fusion EGFP-CRBP-I avec 6XHis balise (EGFP-CRBP-I) est produit dans des cellules de mammifère et est purifié sur résine Ni-NTA avant l'expérience. EGFP-CRBP-I peuvent être conservés dans du PBS avec des inhibiteurs de protéase pour une courte période de temps à 4 ° C. En variante, la protéine de fusion is congelé à -80 ° C dans de petites aliquotes.
  2. Avant les réactions, préparer une bloqué Microfluor-2 plaque et membranes comme décrit ci-dessus. Laver les puits revêtus de la plaque Microfluor-2 une fois avec 200 ul de PBS avant l'addition de la suspension de la membrane (50 pi par puits).
  3. En temps réel rétinol-EGFP FRET est mesuré à l'aide Polarstar Omega avec le filtre d'excitation 320EX et les filtres d'émission 460-10 et 510-10 en utilisant simultanément duel d'émission optique de fluorescence. Le programme est réglé sur le mode de lecture Endpoint. Le mode Plaque peut également être utilisé pour mesurer une évolution dans le temps si les intervalles de temps ne sont pas modifiées. Le signal provenant de chaque point de temps est la moyenne de 10 mesures (calcul de la moyenne orbital d'un diamètre de 2 mm) et le gain est fixé à 1.800 par canal. La plaque est agitée pendant 10 secondes à 500 tours par minute à l'aide de double agitation orbitale avant chaque mesure.
  4. Pour commencer, les réactions EGFP-CRBP-I (typiquement une concentration de 1 uM final) est ajouté aux puits. La plaque est lue surCE à l'aide du mode de lecture Endpoint avant holo-RBP est ajouté à 0 min. Dès que holo-RBP est ajouté, la réaction est suivie en continu par mesure toutes les 5-10 minutes pour hr 1-2.
  5. Après toutes les mesures sont effectuées, télécharger les données brutes (exemple de la figure 3) à partir du logiciel Omega analyse des données vers Microsoft Excel pour l'analyse de données telles que décrites ci-dessus.
  6. Rétinol-EGFP FRET est calculée par la variation dynamique dans le rapport des pics d'émission accepteur / donneur 47. L'équation 41 à calculer ce ratio est [(510 t -510 b) / (460 t -460 b)], où 510 tonnes, 510 b, 460 t et 460 b représentent les émissions à 510 nm après le début de la réaction ( t = temps point), à 510 nm avant le rétinol ou holo-RBP est ajouté (b = fond), à 460 nm après le début de la réaction (t = instant), et à 460 nm avant le rétinol ou holo-RBP est ajouté (b = fond), respectivement.

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Résultats

Nous présentons les résultats ici représentatives des holo-RBP production et la purification par HPLC (figure 1), analyse en temps réel de STRA6 catalysée par la libération de rétinol-RBP holo et le chargement en rétinol-RBP apo (figure 2) et analyse en temps réel des STRA6 catalysée par le transport du rétinol à partir holo-RBP pour EGFP-CRBP-I (Figure 3).

Sans repliement, RBP produit dans des bactéries est pratiquement complètement mal rep...

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Discussion

Nous partageons ici un protocole optimisé RBP RBP production en raison des procédures de production et de purification sont essentielles pour générer des RBP correctement repliée. Compte tenu de la possibilité que des espèces RBP mal repliées et la présence de quantités infimes de protéines bactériennes, même dans purifiée par HPLC bactéries produites RBP, il est utile d'utiliser des pratiques commerciales restrictives natif à partir du sérum pour confirmer une conclusion liée à des pratiques commerciales restrictiv...

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Déclarations de divulgation

Aucun conflit d'intérêt déclaré.

Remerciements

Soutenu par National Institutes of Health subvention R01EY018144.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Nom de réactif / Matériel Entreprise Numéro de catalogue Commentaires
chlorhydrate de guanidine EMD 5010
cystine Sigma C8755
cystéine Sigma C7352
EDTA Pêcheur BP118-500
Tris Pêcheur 7786-1
TNT EMD 3860
rétinol Sigma R7632
carbénicilline Pêcheur BP2648-5
IPTG EMD 5810
PBS EMD 6508
NaCl Pêcheur BP358-10
Ni-NTA Qiagen 1018244
imidazole EMD 5720
heptane EMD HX0295-1
La caséine Blocker Percer 37528
Amicon Ultra 15 concentrateur (MWCO10 K) Millipore UFC901024
Microfluor-2 plaque Pêcheur 14-245-177
Hamilton seringue étanche aux gaz # 1710 Pêcheur 14-824-655

Références

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