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L'isolement et la différenciation des cellules stromales vasculaires de cellules Beige / Brite

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DOI :

10.3791/50191

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28 mars 2013

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1UCSF Diabetes Center and Department of Cell and Tissue Biology, University of California, San Francisco , 2Department of Biology, University of Copenhagen, Denmark, 3National Institute of Nutrition and Seafood Research, Bergen, Norway

Dans cet article

Résumé

Préadipocytes primaires blanches isolées à partir de tissus adipeux blancs chez la souris peuvent être différenciées en cellules beige / brite. Présenté ici est un système modèle cellulaire fiable pour étudier la régulation moléculaire de "brunissement" de graisse blanche.

Résumé

Adipocytes bruns ont la possibilité de découpler la chaîne respiratoire dans les mitochondries et dissiper l'énergie chimique sous forme de chaleur. Développement d'UCP1-positifs adipocytes bruns dans les tissus adipeux blancs (que l'on appelle les cellules beige ou brite) est fortement induite par une variété de facteurs environnementaux tels que l'exposition au froid ou chronique par des agonistes PPARy, par conséquent, ce type de cellule a un potentiel en tant que cible thérapeutique pour traitement de l'obésité. Bien que la plupart des lignes adipocytes immortalisés ne peut pas résumer le processus de «brunissement» de la graisse blanche dans la culture, les adipocytes primaires isolés de la fraction vasculaire du stroma dans le tissu sous-cutané adipeux blanc (WAT) fournir un système fiable cellulaire pour étudier le contrôle moléculaire du développement des cellules beige / brite . Nous décrivons ici un protocole pour une isolation efficace des pré-adipocytes primaires et pour induire la différenciation des cellules beige / brite en culture. L'effet de brunissement peut être évaluée par l'expression de la graisse brune sélective marqueteurs tels que UCP1.

Introduction

L'obésité est dramatiquement dans le monde augmente et est maintenant considéré comme l'un des problèmes les plus graves pour la santé publique 1. Cette condition est liée à un déséquilibre par rapport à l'apport énergétique de dépenses et les résultats de l'excès d'énergie stockée sous forme de lipides dans le tissu adipeux blanc (WAT). WAT élargie est associée à une augmentation de masse corporelle et de poids, tandis que le tissu adipeux brun est capable de dissiper l'énergie en excès pour produire de la chaleur. Ainsi BAT peut fonctionner comme une protection contre le froid et l'obésité 2,3. Ceci est réalisé par le découplage du transport des électrons dans les mitochondries par la protéine découplante 1 (UCP1). Cette protéine est considérée comme une caractéristique de thermogenèse sans frisson dans la MTD 3. Plusieurs études de ces dernières années ont révélé que les humains adultes ont fonctionnel 4-8 BAT et, par conséquent, la manipulation des MTD chez l'homme peut être une intervention thérapeutique potentielle dans la lutte contre l'obésité et ses maladies associées.

jove_content «preuves> actuelles indiquent que les deux types d'adipocytes bruns existent chez les rongeurs;« classique »ou« pré-existant "graisse brune se développe pendant la période prénatale et forme dédiée dépôts adipeux brun dans la région inter-scapulaire et d'autres tissus périphériques D'autre part. , un "inductible" sous forme de graisse brune (que l'on appelle les cellules brite ou beige) se développe pendant la phase post-natale et semble intercalées dans les tissus adipeux blancs. Les deux types d'adipocytes bruns sont également séparés par différentes origines développementales. Alors que la pré-existant adipocytes bruns proviennent de myoblastsic-Myf5 comme précurseurs, les inductibles brite / beige cellules intercalées dans WAT proviennent d'une lignée non Myf5 9,10. Par ailleurs, les voies de régulation de ce type de cellule est susceptible d'être différente de la brune Myf5 dérivé adipocytes 11. Le développement des cellules beiges (ie "brunissement" de la graisse blanche) peuvent être activés en réponse à l'exposition au froid chronique et àβ3-adrénergiques agonistes ou agonistes PPARy chez les adultes 12-14. Les cellules beige / brite sont susceptibles d'être une cible thérapeutique prometteuse pour la manipulation de la balance énergétique globale et peut potentiellement faire partie du traitement de l'obésité; par conséquent, il est important de comprendre les mécanismes moléculaires précis et voies de signalisation par laquelle des signaux environnementaux contrôlent le développement de beige cellules.

Pour comprendre le contrôle moléculaire du brunissement de la graisse blanche, des expériences in vitro sont mieux adaptés comme la différenciation des pré-adipocytes se déroule plutôt de manière asynchrone et il est difficile de détecter les cellules dans 15 situ. Bien que les études sur le développement des adipocytes ont jusqu'ici été effectuées principalement sur des lignées cellulaires telles que les cellules 3T3-L1, 3T3-F442A ou Hib1, ces lignées cellulaires semblent manquer de la signature moléculaire des cellules beiges. D'autre part, les adipocytes primaires isolées à partir de WAT sous-cutanée sont les plus susceptibles de récapituler les process de brunissement de la graisse blanche dans une cellule autonome de la mode. Ici, nous fournissons un protocole pour une isolation efficace de la fraction stroma-vasculaire du tissu adipeux et pour induire le brunissement de la graisse blanche en réponse à des agonistes PPARy. La rosiglitazone a été montré pour être un médiateur particulièrement efficace de brunissement dans ces cellules. Comme suggéré précédemment 16, ce système cellulaire peut être utilisé pour servir un système cellulaire fiable pour étudier le développement des cellules beige / brite.

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Protocole

1. Préparer milieu de digestion

Faire 5 ml par 5 souris par du tissu (environ 1 ml / 1 g tissu adipeux).

  1. Peser des enzymes de digestion:
    - Collaginase D: 1,5 u / ml (1108874103, 1 g, Roche, 70334223)
    - Dispase II: 2,4 u / ml (04942078001, 0.980 mg / lyo, Roche, 11466200)
  2. Ajouter 25 ml de PBS et bien mélanger pour dissoudre
  3. Ajouter CaCl 2 juste avant la digestion du tissu à une concentration finale de 10 mM

2. Disséquer les tissus adipeux des souris

  1. La dissection doit être effectuée avec soin et immédiatement après les souris (6-8 semaines) sont sacrifiés. Travailler avec de l'éthanol stérile pulvérisé sur la fourrure de la souris avant de l'ouvrir. Placez le tissu directement dans PBS propre, distincte BAT interscapulaire et sous-cutanée inguinale WAT.
  2. Pour BAT interscapulaire: avoir la souris placé à l'arrière fait face, découpé le long du dos et tout le chemin vers le cou. Le brunle tissu adipeux se trouve juste sous la peau entre les épaules (interscapulaire). MTD peuvent être considérés comme les deux lobes en forme de papillon,. Une fine couche de graisse blanche couvrant la MTD devrait être soigneusement enlevés.
  3. Pour sous-cutanée WAT (WAT inguinale): enlever la peau. Inguinale WAT se trouve directement sous la peau des deux côtés, en commençant presque sur le dos et aller à côté, à l'intérieur des cuisses et le bas en direction du testicule.

3. Couper et digérer le tissu adipeux

  1. Supprimer rapidement toute contamination, comme les cheveux, les muscles squelettiques et du tissu conjonctif des coupes de tissus.
  2. Séchez les tissus rapidement sur le papier pour ne pas diluer le milieu de dissection avec du PBS et le placer sur une plaque sèche.
  3. Ajouter milieu de digestion (ajouté CaCl 2 avant la digestion) et émincer le tissu en petits morceaux. Mélangez bien à la pipette de haut en bas avec une pipette de 5 ml. Transférez les tissus hachés dans des tubes de 50 ml avec le reste de la digestion moyen, mélangez encore plus par pipetage de haut en bas.
  4. Digestion à 37 ° C sous agitation constante à 150 tours par minute pendant 40-50 min. Vérifiez toutes les 10-15 minutes pour vous assurer que la digestion se passe bien et pour éviter une sur-digestion.

Remarque: milieu de digestion correcte et le temps sont importants. Le tissu doit être bien digéré, mais la digestion excès peut endommager les cellules.

4. Suspension Cellulaire filtre

  1. Arrêtez la digestion en ajoutant 5 ml de milieu complet (DMEM/F12 contenant FPS de 10% et P / S). Les cellules doivent être presque complètement homogène. Bien mélanger par pipetage.
  2. Centrifuger à 700 xg pendant 10 min.
  3. SVF peut désormais être considérée comme une pastille brunâtre sur le fond du tube. Aspirer le gras des adipocytes matures couche sur le dessus et plus de la couche liquide - garder le culot et le dissoudre dans 10 ml de milieu complet. Mélangez bien.
  4. Placez un tamis cellulaire (50-70 um de diamètre) sur une 50 nouveaux Tube ml et filtrer la suspension de cellules.

5. Cellules de la plaque

  1. Transfert suspension de cellules dans un tube de 15 ml et centrifuger à 700 xg pendant 10 min.
  2. Aspirer à moyen et à remettre en suspension le culot dans 10 ml de milieu complet. Pipette et bien mélanger.
  3. Estimer combien de plaques sont nécessaires. Cela peut varier et dépend de la grosseur des granules. Une règle générale est de 2 des plaques de 10 cm de 5 souris pour inguinale WAT et une plaque de 10 cm pour les MTD.
  4. Cellules de la plaque sur les plats revêtus de collagène (R & D) dans un milieu complet
  5. 1-2 heures après l'étalement des cellules, moyen aspirer, laver avec du PBS deux fois et ajouter du milieu frais. Cette étape est importante, car cela peut éliminer les globules rouges, les cellules immunitaires et d'autres contaminants.

6. Différencier les cellules

  1. Faire l'entretien et les médiums à induction.

Un milieu d'entretien

Milieu complet additionné de:

ent "> L'insuline, concentration finale. 5 pg / ml (5 mg / ml, *** 100 ul d'acide acétique dans 10 ml H 2 O pour préparer pH de l'eau acidifiée 2.5. actions magasin dissoudre l'insuline dans l'eau acidifiée. à -20 ° C)

3,3 ',5-triiodo-L-thyronine (T3), concentration finale. 1 nM (10 uM actions, *** dissoudre T3 dans NaOH 1N et ajouter du milieu pour faire 10 en stock uM. Sigma cat # T-2877)

Conserver à 4 ° C, bon pour une semaine

Un milieu d'induction

Un milieu d'entretien contenant des composés suivants:

Indométhacine, concentration finale. 125 microns (0,125 stock M dans l'éthanol, le chat Sigma # I-7378). Indomethacin doit être chauffé à 60 ° C doit être dissoute.

Dexaméthasone, concentration finale. 2 pg / ml (2 mg / ml dans de l'éthanol chaussette, Sigma cat # D-1756)
3-isobutyl-1-méthylxanthine (IBMX), concentration finale. 0,5 mM (0,25 stock M dans le DMSO, Sigma cat # I-5879)
La rosiglitazone, concentration finale. 0,5 uM(10 actions mM dans du DMSO, Sigma cat # R-2408)

Remarque: Assurez-induction du milieu frais à chaque fois.

  1. Cultivez adipocytes primaires jusqu'à la confluence de 95-97% en milieu complet (confluente mais pas trop emballé)
  2. Changez régulièrement milieu complet avec un milieu d'induction (jour 0)
  3. Après 48 heures (jour 2), modifier un média à l'entretien avec la rosiglitazone (0,5 uM)
  4. Après plus de 48 heures (jour 4), changer de milieu d'entretien frais avec la rosiglitazone (1 uM) pour 2-3 jours supplémentaires. 6-7 jours après l'ajout du milieu d'induction, les cellules sont complètement différenciées de cellules adipeuses matures et sont remplis de gouttelettes d'huile. Gouttelettes apparaissent autour de 3-4 jours après l'induction.

Remarque: moyen Changer tous les 2-3 jours jusqu'à ce que les cellules sont complètement différenciées.

Les cellules peuvent maintenant être récoltées et expression de l'ARNm de Ucp1 et otheR Brown gènes spécifiques des adipocytes peut être mesurée par qRT-PCR. Western blot est utilisé pour détecter des protéines.

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Résultats

Brunissement des adipocytes primaires sont accessibles par la mesure de l'expression d'ARNm de Ucp1 et d'autres gènes de graisse brune spécifique ou sélectif par QRT-PCR. La figure 1 présente des données d'expression de gènes dans inguinales WAT-adipocytes primaires dérivés. Les cellules ont été induites à se différencier en présence de deux doses différentes de la rosiglitazone à 50 nM et 500 nM, respectivement. Un sous-ensemble de cellules a été traité avec de la forskoline à ...

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Discussion

Nous présentons ici un système cellulaire fiable pour étudier le développement des cellules beige / brite dans les adipocytes en culture primaire chez la souris. Par rapport à plusieurs lignées cellulaires immortalisées disponibles, ce système est susceptible d'offrir une importance accrue au brunissement de la graisse blanche in vivo.

Même si l'étude de ces adipocytes primaires offre certains avantages, il existe aussi quelques limitations et les préoccupations qui sont imp...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent n'avoir aucun conflit d'intérêts financiers.

Remerciements

Nous remercions Haruya Ohno, Kosaku Shinoda, Louis Sharp, Emi Tomoda, et Lauren Ruiz de discussion, une aide technique et aide à la rédaction du manuscrit. Ce travail a été soutenu par des subventions du NIH (DK087853), du Programme de recherche biomédicale et percée de Asubio Pharm Inc SKULA a été pris en charge par un ACTIONS bourses de doctorat de l'Université de Copenhague et l'UE projet FP7 Diabat (SANTÉ-F2 -2011 à 278373) à Lise Madsen et Karsten Kristiansen. Nous reconnaissons aussi le centre DERC subvention (NIH P30 DK063720).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Réactif
Collaginase D Roche 11088874103
Dispase II Roche 04942078001
CaCl 2
Milieu DMEM Pêcheur 10017-CV Avec 2,5 g / l de glucose et L-glutamine sans pyruvate de sodium
Insuline
T3 (3,3 ',5-triiodo-L-thyronine) Sigma T-2877
Indomethacin Sigma I-7378
Dexaméthasone Sigma D-1756
IBMX Sigma Je-5879
La rosiglitazone Sigma R-2408
Équipement
Plats revêtus de collagène BD 354450 Plaques de 10 cm
70 um filtre BD Falcon 352350 Cellule filtre, nylon 70 um 1/EA

Références

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Mots-clés

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