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Article de méthode

Mesure de transport de cations Na, K et H, K-ATPase dans

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DOI :

10.3791/50201

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19 février 2013

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1Institute of Chemistry, Technical University of Berlin, 2The Vollum Institute, Oregon Health & Science University

Dans cet article

Résumé

Nous décrivons une méthode pour quantifier l’activité des ATPases de type P contre-transportant K+ par expression hétérologue des enzymes dans les ovocytes de xénope et en mesurant l’absorption de Rb+ ou Li+ dans les cellules individuelles par spectrophotométrie d’absorption atomique. La méthode est une alternative sensible et sûre aux expériences de flux de radio-isotopes, facilitant les études cinétiques complexes.

Résumé

Alors que le transport cationique par le transporteur membranaire électrogénique Na+,K+-ATPase peut être mesuré par électrophysiologie, la H+,K+-ATPase gastrique fonctionnant électroneutrement est plus difficile à étudier. De nombreux essais de transport utilisent des radio-isotopes pour obtenir un rapport signal/bruit suffisant, mais les mesures de sécurité nécessaires imposent des restrictions sévères concernant l’exposition humaine ou la conception des essais. De plus, le transport d’ions à travers les membranes cellulaires est influencé de manière critique par le potentiel membranaire, qui n’est pas directement contrôlé dans la culture cellulaire ou dans les préparations de protéoliposomes. Ici, nous utilisons la sensibilité exceptionnelle de la spectrophotométrie d’absorption atomique (AAS) envers les traces d’éléments chimiques pour mesurer le transport de Rb+ ou Li+ par Na+,K+- ou H+,K+-ATPase gastrique dans des cellules uniques. En utilisant les ovocytes de xénope comme système d’expression, nous déterminons la quantité de Rb+ (Li+) transportée dans les cellules en mesurant des échantillons d’homogénats d’ovocytes uniques dans un appareil AAS équipé d’un four à atomiseur de graphite chauffé transversalement (THGA), qui est chargé à partir d’un échantillonneur automatique. Étant donné que le contexte de l’absorption non spécifique de Rb+ dans les ovocytes témoins ou lors de l’application d’inhibiteurs spécifiques de l’ATPase est très faible, il est possible de mettre en œuvre des schémas de dosage cinétique complexes impliquant simultanément un grand nombre de conditions expérimentales, ou de comparer la capacité de transport et la cinétique des transporteurs mutés spécifiques au site avec une grande précision. De plus, comme l’absorption de cations est déterminée sur des cellules uniques, les expériences de flux peuvent être réalisées en combinaison avec le bridage de tension à deux électrodes (TEVC) pour obtenir un contrôle précis du potentiel et du courant de la membrane. Cela a permis, par exemple, de déterminer quantitativement la stœchiométrie de transport 3Na+/2K+ de la Na+,K+-ATPase et a permis pour la première fois d’étudier la dépendance en tension du transport cationique par la H+,K+-ATPase gastrique fonctionnant de manière électroneutre. En principe, le test n’est pas limité aux protéines membranaires porteuses de K+, mais il peut tout aussi bien fonctionner pour traiter l’activité des transporteurs de métaux lourds ou de métaux de transition, ou l’absorption d’éléments chimiques par les processus endocytotiques.

Introduction

Nous voulions développer une alternative sensible, sûre et peu coûteuse aux expériences de traceurs radioactifs pour étudier l’activité de transport spécifique des protéines membranaires de translocation d’ions afin de contourner les restrictions concernant l’accès aux laboratoires d’isotopes, les exigences de sécurité ou l’utilisation de radio-isotopes coûteux, qui - comme dans le cas du lithium - peuvent même être indisponibles en raison de temps de désintégration extrêmement courts. Nous nous sommes particulièrement intéressés à déterminer l’activité de la H+,K+-ATPase gastrique fonctionnant de manière électroneutre, car l’enzyme ne génère pas de courant et son activité ne peut donc pas être abordée par des méthodes électrophysiologiques. Étant donné que les Na+,K+- et H+,K+-ATPase transportent Rb+ aussi efficacement que K+ (et Li+ également), la haute sensibilité de la technique AAS pour le rubidium ou le lithium devrait faciliter la détection sensible de l’activité de transport. Les spectrophotomètres d’absorption atomique sont des appareils analytiques courants, qui sont largement distribués dans les laboratoires de chimie et devraient être accessibles à un grand nombre de scientifiques intéressés. De plus, nous voulions tirer parti du système d’expression des ovocytes de Xénope, qui utilise de grandes cellules uniques (environ 1,0 à 1,5 mm de diamètre) qui permettent d’obtenir une variabilité remarquablement faible d’une cellule à l’autre en ce qui concerne le niveau d’expression des protéines au sein d’un seul lot. Un calcul simple démontre la faisabilité du dosage AAS : la limite de détection (masse caractéristique) pour le rubidium avec la technique THGA-AAS est de 10 pg ou 1,2,10-13 mol (Rb : 85,47 g/mol), pour le lithium de 5,5 pg ou 7,9,10-13 mol (Li : 6,94 g/mol). Lors de l’expression hétérologue de la Na+,K+-ATPase dans les ovocytes de xénope, des courants de pompe de 100 nA peuvent être obtenus (ce qui équivaut à environ 6,2,2,1011 charges élémentaires par seconde, ou 1,03,10-12 mol s-1), ce qui entraîne un transport de 6,10-6 C de charge en 1 min. Étant donné que le transport d’une charge nette correspond à l’absorption de deux ions Rb+ (due à la stœchiométrie 3Na+/2K+), un courant de 100 nA pendant 1 min correspond à une absorption de 1,2,10-10 mol Rb+. Ainsi, même lors d’une dilution de 1 000 fois (homogénéisation d’un ovocyte d’un volume d’environ 1 μl dans 1 ml d’eau), un échantillon typique de THGA-AAS (20 μl) contient 2,4,4,10-12 mol Rb+ (ou 204 pg), ce qui est bien au-dessus du seuil de détection. Par conséquent, même les transporteurs ayant une activité de transport ou une expression de membrane plasmique plus de 100 fois plus faible peuvent être testés avec la technique en ajustant de manière appropriée le temps de flux de l’expérience.

Étant donné que le taux de pompage dépend sensiblement de la température (les énergies d’activation typiques pour Na+,K+-ATPase sont comprises entre 90 kJ/mol et 130 kJ/mol1-3, ce qui entraîne une augmentation d’environ 30 % du taux de renouvellement lors d’un passage de 20 °C à 22 °C), il est obligatoire d’effectuer les mesures de flux sous contrôle précis de la température (climatisation) avec des solutions tampons bien équilibrées. De plus, les ovocytes doivent être soigneusement sélectionnés en fonction de leur taille homogène pour l’expression d’un transporteur d’ions. Avec ces précautions, il est possible d’atteindre régulièrement des erreurs-types expérimentales inférieures à 10 % avec environ 10 cellules par condition expérimentale. En utilisant cette technique, nous avons pu déterminer par exemple les affinités apparentes Rb+ du transport des cations4-6, l’influence du pH extra- et intracellulaire7 et l’effet des mutations des résidus impliqués dans la coordination des cations pendant le transport4,8. L’un des avantages de cette technique est que les flux d’ions peuvent également être déterminés en combinaison avec le serrage de tension des ovocytes à deux électrodes, ce qui assure d’une part un contrôle précis du potentiel membranaire pendant le transport et d’autre part permet de corréler le flux d’ions avec le courant membranaire. Ainsi, il a été possible de vérifier la stœchiométrie 3Na+/2K+ de la Na+,K+-ATPase (voir résultats exemplaires ci-dessous) et de déterminer la dépendance en tension du transport cationique de la H+/K+-ATPase7 gastrique.

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Protocole

1. Constructions d'ADNc et expression protéique dans les ovocytes de Xenopus

Le cDNA de la protéine membranaire d'intérêt doit être cloné dans un vecteur adapté à l'expression dans les ovocytes de Xenopus laevis, tel que pTLN9 ou pcDNA3.1X10. Ces vecteurs optimisés contiennent les régions non traduites (UTR) 5' et 3' du gène β-globine de Xenopus laevis encadrant le site de clonage multiple (MCS), une séquence promoteur pour l'ARN polymérase (pTLN : SP6, pcDNA3.1X : T7) située en amont de l'UTR 5', une séquence poly-A en aval du MCS pour assurer la stabilité de l'ARNc dans les cellules, ainsi qu'une autre séquence en aval composée de sites d'endonucléases de restriction à coupure unique permettant la linéarisation du plasmide, afin qu'il serve de matrice pour la transcription in vitro de l'ARNc.

Pour distinguer l'activité de la protéine humaine Na surexprimée+/+-ATPase (α2-sous-unité+β1-sous-unité) à partir du Na endogène+/+-ATPase des ovocytes, les mutations Q116R et N127D ont été introduites afin d'obtenir une protéine résistante à l'ouabaïne avec une CI50 dans la gamme millimolaire11. Dans le cas de H+/+-ATPase, des mesures de flux ont été réalisées en utilisant le H+/+- Mutant de la sous-unité α de l'ATPase, S806C, puisque Rb+ les flux ont été corrélés avec des données cinétiques provenant d'expériences de fluorométrie en condition de blocage de tension (VCF). La technique VCF (https://www.jove.com/video/2627/ examen de la dynamique conformationnelle des protéines membranaires in situ par marquage fluorescent dirigé vers un site spécifique)12 repose sur l'attachement spécifique à un site d'un fluorophore à un résidu de cystéine introduit de manière stratégique, qui signale les changements conformationnels de l'enzyme.

2. Linéarisation et purification du modèle d'ADN

  1. Pour la linéarisation du modèle d'ADN, digérer 3 μg d'ADN plasmidique dans un volume réactionnel de 50 μl avec 5 μl de tampon 10x concentré adapté à l'enzyme de restriction et 10 U d'enzyme de restriction pendant 1 heure à 37 °C.
  2. Purifier l'ADN linéarisé à l'aide du High-Pure PCR Product Purification Kit (Roche Applied Science). Ajouter d'abord 350 μl de tampon de liaison (contenant de la guanidiniumisothiocyanate) au tube de digestion. Après cette étape de purification, le modèle d'ADN linéarisé est de « qualité ARN » car la guanidiniumisothiocyanate est un dénaturant protéique efficace et détruit en particulier les RNases, qui sont des contaminants fréquents dans les laboratoires de biologie moléculaire.
  3. Insérer les colonnes de centrifugation dans des tubes de collecte, charger la colonne avec la solution d'ADN obtenue à l'étape 2, centrifuger à 13 000 x g pendant 30 secondes et jeter l'écoulement.
  4. Ajouter 500 μl de tampon de lavage sur la colonne. Centrifuger 1 minute à 13 000 x g et jeter l'écoulement.
  5. Ajouter 200 μl de tampon de lavage sur la colonne. Centrifuger 1 minute à 13 000 x g pour sécher complètement la colonne.
  6. Placer la colonne de centrifugation dans un nouveau tube Eppendorf de 1,5 ml et ajouter 50 μl d'eau sans nucléase (Ambion Product # AM9937) sur la colonne. Éluer par centrifugation pendant 1 minute à vitesse maximale.
  7. Après l'élution, concentrer la solution contenant l'ADN à environ 15 μl. Cette étape garantit que la solution contient 0,5 μg d'ADN linéarisé dans 3 μl, concentration recommandée pour la réaction suivante de transcription in vitro d'ARNc.

3. Synthèse d'ARNc in vitro

  1. Choisir le kit mMessage mMachine approprié (Ambion Produit n°1340, n°1344) en fonction de la séquence du promoteur sur le plasmide (SP6, T7). Dans un volume total de réaction de 10 μl, ajouter 3 μl d'ADN linéarisé de l'étape précédente et 1 μl de tampon de transcription aux échantillons préaliquotés de 5 μl de mélange NTP-cap. La préaliquotation du mélange NTP-cap est nécessaire afin d'éviter des cycles de congélation-décongélation fréquents, qui pourraient entraîner une dégradation des nucléoside-triphosphates. Enfin, ajouter 1 μl de l'ARN polymérase appropriée, mélanger brièvement et centrifuger rapidement le mélange de réaction.
  2. Incuber le mélange de réaction pendant 1 à 2 heures à 37 °C. Le temps d'incubation ne doit pas dépasser 2 heures, car cela pourrait entraîner une réduction du rendement ou de la qualité de l'ARNc.
  3. Ajouter 15 μl de solution de LiCl 3 M glacée provenant du kit, 15 μl d'eau sans nucléase froide, mélanger brièvement (ne pas vortexer), puis centrifuger brièvement l'échantillon à 11 000 x g pendant 10 secondes, et conserver à -20 °C pendant au moins 30 minutes afin de permettre la précipitation de l'ARNc.
  4. Prérefroidir la centrifugeuse à 4 °C et centrifuger pendant au moins 15 minutes à 13 000 x g après la précipitation.
  5. Retirer soigneusement et complètement le surnageant du culot brun pâle au fond du tube, puis ajouter 150 μl d'éthanol à 70 % de qualité ARN préalablement refroidi à -20 °C. Centrifuger à 4 °C pendant 5 minutes à 13 000 x g.
  6. Éliminer complètement le surnageant, sécher brièvement (1-2 minutes) le culot d'ARNc restant dans un évaporateur centrifuge (par exemple modèle Eppendorf Concentrator 5301) à température ambiante.
  7. Resuspendre le culot dans 12 μl d'eau froide sans nucléase. ATTENTION : Toutes les étapes suivantes doivent être effectuées en conservant l'échantillon d'ARNc sur de la glace.
  8. Déterminer la concentration d'ARNc à l'aide d'un spectrophotomètre (par exemple Eppendorf BioPhotometer).
  9. Vérifier l'intégrité de l'ARNc par électrophorèse sur gel d'agarose. ATTENTION : Ce contrôle croisé est nécessaire, car même un ARN partiellement dégradé donne une absorption UV non nulle. Pour l'électrophorèse de l'ARNc, utiliser une chambre d'électrophorèse soigneusement nettoyée, remplie de buffer TAE fraîchement préparé, et un gel d'agarose à 1 % fraîchement coulé. Si une contamination par des RNases est suspectée dans la chambre d'électrophorèse ou le tampon, remplir la chambre avec du HCl 0,1 M pendant 1 heure pour le nettoyage, et préparer le tampon TAE avec de l'eau sans nucléase.
  10. Conserver l'ARNc à -20 °C jusqu'à utilisation. L'ARNc peut être conservé pendant au moins un an à -20 °C.

4. Obtention de matériel ovarien à partir de femelles Xenopus laevis par ovar ectomie partielle

Ce protocole a été approuvé par l'autorité étatique compétente (Landesamt für Gesundheit und Soziales Berlin, The Senate of Berlin, Germany).

  1. Ne pas nourrir la grenouille au moins 12 heures avant la chirurgie afin d'éviter les vomissements.
  2. Préparer une solution contenant 2 g d'anesthésique local tricaine (MS-222) dissous dans 1 L d'eau ajustée à un pH de 7,0 à l'aide d'un tampon HEPES 5 mM. PRÉCAUTION : Porter des gants en nitrile en tout temps lors de la manipulation du MS-222 et préparer la solution dans une hotte de sécurité chimique.
  3. Immerger la grenouille dans la solution de tricaine (durée maximale : 10 min) jusqu'à ce qu'elle ne présente plus de réflexe d'orientation. Pour vérifier l'absence de réaction, essayer de retourner la grenouille sur le dos dans vos mains et observer tout mouvement de défense.
  4. Sortir la grenouille de la solution de tricaine à la main et rincer l'animal avec de l'eau du robinet froide pour éliminer l'anesthésique.
  5. Placer la grenouille sur le dos sur un lit de glace recouvert d'une serviette en papier humide afin d'éviter d'endommager la peau de la grenouille par contact direct avec la glace. Maintenir la peau de l'animal humide en tout temps pendant l'opération pour éviter qu'elle ne s'assèche. Le placement sur la glace prolonge la durée de l'anesthésie.
  6. Pratiquer une petite incision abdominale (de 8 à 10 mm de longueur) à l'aide de ciseaux pointus, soit du côté gauche, soit du côté droit de la ligne médiane de la grenouille. PRÉCAUTION : Faire attention de ne pas endommager la ligne latérale. Les chirurgies ultérieures doivent être réalisées en alternant les côtés afin de permettre une bonne récupération du tissu ovarien sous-jacent. Généralement, il faut traverser trois couches de tissu (la peau externe, une fine couche de tissu conjonctif blanc – l'aponévrose – et une couche musculaire).
  7. Après avoir ouvert l'abdomen, saisir des fragments de lobes ovariens à l'aide de pinces contondantes et les tirer doucement vers l'extérieur. À titre indicatif, retirer environ 3 à 5 cm de tissu ovarien par incision. En cas de lésion de petits vaisseaux sanguins et de saignement, appliquer une pression avec une tige en plastique stérile ou refroidir la lésion avec de la glace jusqu'à l'arrêt du saignement.
  8. Fermer chirurgicalement l'incision en utilisant un point d'interrompu avec un fil de suture Ethicon Vicryl 4.0 (Johnson & Johnson #V633H). Utiliser des instruments chirurgicaux pour la suture et faire deux ou trois nœuds séparés le long de l'incision. PRÉCAUTION : Il est important que chaque nœud prenne les trois couches de tissu en une seule étape.
  9. Après l'opération, placer la grenouille dans un bac d'eau légèrement incliné (30 L), contenant juste assez d'eau pour recouvrir le fond, de sorte que les narines de l'animal restent au-dessus du niveau de l'eau pour permettre la respiration. Couvrir l'animal pendant la période de réveil (environ 1 à 2 heures) avec une serviette en papier humide afin d'éviter le dessèchement de la peau sensible.
  10. Lorsque l'animal est à nouveau actif, remplir complètement le bac d'eau et maintenir la grenouille à l'écart des autres animaux pendant 3 à 4 jours afin de surveiller sa récupération et la cicatrisation de la plaie.
  11. Après la chirurgie, éviter toute intervention ultérieure sur la grenouille pendant au moins 3 mois afin de permettre une récupération complète de l'animal et de son tissu ovarien. À titre indicatif, un maximum de 6 à 8 chirurgies peut être effectué sur chaque grenouille.

5. Isolement enzymatique des ovocytes individuels

  1. Couper le matériel ovarien en morceaux plus petits à l’aide de ciseaux et transférer le tissu dans Solution de Ringer pour ovocyte sans Ca2+ (110 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl₂)2, 5 mM HEPES, pH 7,4) contenant du collagénase (20 mg/ml, de type 1A provenant de Clostridium hystolyticum, Sigma #C9891) et inhibiteur de la trypsine (10 mg/ml, de type III-O provenant du blanc d'œuf de poulet, Sigma #T2011).
  2. Agiter doucement la solution de digestion pendant 2,5 h à 18 °CPar la suite, suivre l'évolution de la digestion par intervalles de 15 minutes jusqu'à ce que la majorité des ovocytes soient séparés du tissu folliculaire.
  3. Laver les ovocytes plusieurs fois dans un tube Falcon de 50 ml avec Solution de Ringer pour ovocyte sans Ca2+ jusqu'à ce que la solution soit suffisamment débarrassée des débris tissulaires.
  4. Conserver les ovocytes dans Solution Ringer pour ovocyte contenant du Ca2+ (110 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl₂)2, 2 mM CaCl₂2, 5 mM HEPES, pH 7,4) contenant de la gentamicine (50 μg/ml) à 18 °C.

6. Injection d'ARNc

  1. Pour l'expression de la Na+,K+- ou de la H+,K+-ATPase, injecter les ovocytes avec 50 nl de solution d'ARNc contenant 25 ng d'ARNc de la sous-unité α et 5 ng d'ARNc de la sous-unité β à l'aide d'une pompe d'injection Nanoject II motorisée (Drummond Scientific Inc.), avec des tubes d'hématocrite de 3,5" (Drummond #3 000-203-G/X). ATTENTION : La quantité d'ARNm peut varier selon la protéine cible et devra peut-être être ajustée pour une expression maximale par immunobuvardage.
  2. Pour chaque condition de flux (par exemple à une concentration spécifique de Rb+), injecter 18 à 22 ovocytes. Parmi ceux-ci, 50 % seront analysés dans des conditions « +flux » (par exemple une certaine concentration de Rb+), et 50 % dans des conditions « -flux » (par exemple avec la concentration choisie de Rb+ et un inhibiteur spécifique de l'enzyme à concentration saturante, comme 10 mM d'ouabaïne pour la Na+,K+-ATPase ou 10 μM de SCH28080 à pH 5,5 pour la H+,K+-ATPase).
  3. Après l'injection, transférer les ovocytes séparément dans des plaques de 96 puits à moitié remplies de solution de Ringer pour ovocytes contenant du Ca2+ et 50 μg/ml de gentamicine, à 18 °C.
  4. Couvrir la plaque de 96 puits avec du Parafilm pour éviter une évaporation excessive.
  5. Incuber les ovocytes pendant 2 à 7 jours (selon la protéine d'intérêt) à 18 °C. Si un stockage des ovocytes au-delà de 3 jours est nécessaire, il est recommandé de renouveler le tampon d'incubation dans les micropuits tous les 3 jours.
  6. Pour chaque série de données de flux (par exemple une expérience de titration en [Rb+]), environ 10 ovocytes non injectés (ou injectés avec 50 nl d'eau sans nucléase) doivent être analysés dans des conditions « +flux » et « -flux ». Incuber donc un nombre suffisant d'ovocytes témoins de la même manière que les ovocytes injectés avec l'ARNc avant l'analyse du flux.

Prétraitement des ovocytes exprimant une ATPase hétérologue

Procédure de chargement en Na+

Pour les mesures fonctionnelles de la Na+/K+-ATPase, il est important d'augmenter la concentration intracellulaire en Na+13, comme suit :

  1. Transférer les ovocytes dans Na+ Tampon de charge (110 mM NaCl, 2,5 mM citrate de sodium, 2,5 mM MOPS, 2,5 mM TRIS, pH 7,4) pendant 45 min sur glace.
  2. Pour une récupération ultérieure, incuber les ovocytes dans Tampon de post-chargement « PLB » (100 mM NaCl, 1 mM CaCl₂)2, 5 mM BaCl₂2, 5 mM NiCl2 et 2,5 mM de MOPS, 2,5 mM de TRIS, pH 7,4) pendant au moins 30 min sur de la glace.
  3. Conserver les ovocytes dans PLB sur de la glace jusqu'à utilisation.

7. Pré-blocage de la Na+,K+-ATPase endogène

PRÉCAUTION : Étant donné que les ovocytes de Xenopus expriment une Na+,K+-ATPase endogène, il est important de bloquer cette pompe endogène avant les expériences de flux de Rb+, comme suit :

  1. Procédez maintenant au blocage de la Na+,K+-ATPase endogène en incubant les ovocytes dans du tampon post-chargement contenant 100 μM d'ouabaïne pendant 15 min à température ambiante.

8. Électrophysiologie

  1. Préparer les microélectrodes en tirant des capillaires en borosilicate (GB150F-8P, Science Products GmbH) à l’aide d’un tireur de micropipettes à deux étapes (modèle PC-10, Narishige).
  2. Remplir les électrodes en verre par l’arrière avec du KCl 3 M. Pour les expériences de clampage de tension à deux électrodes (TEVC) avec la H+,K+-ATPase, nous recommandons d’utiliser du NaCl 3 M à la place, ce qui a permis d’obtenir des enregistrements de courant plus stables. Monter la pipette au-dessus du fil Ag/AgCl des supports d’électrodes microscopiques du dispositif de clampage de tension à deux électrodes.
  3. Insérer les microélectrodes en verre et deux ponts d’agar (ces derniers doivent être préparés avec du NaCl/agar au lieu du KCl/agar couramment utilisé), qui relient les électrodes de référence Ag/AgCl à la solution du bain, dans la chambre d’enregistrement (Warner Instr., modèle RC-10) préalablement remplie de tampon de mesure (par exemple PLB avec 10 μM d’ouabaïne pour la Na+,K+-ATPase).
  4. Mettre l’amplificateur de clampage de tension (Turbo TEC-10CX, NPI Electronics, Tamm, Allemagne) en mode « OFF ».
  5. Vérifier séparément la résistance de chaque électrode en verre (les deux doivent se situer dans la plage de 0,5 à 2 MΩ).
  6. Vérifier les potentiels de décalage des électrodes de tension et de courant sur l’affichage approprié de l’amplificateur TEVC. En cas d’écart par rapport à zéro, ajuster le décalage à l’aide des régulateurs de décalage correspondants de l’amplificateur.
  7. Placer un ovocyte au centre de la chambre et pénétrer délicatement la membrane avec l’électrode de courant et l’électrode de tension.
  8. Vérifier l’affichage du potentiel sur l’amplificateur. La valeur affichée pour le potentiel de l’électrode de tension correspond maintenant au potentiel de repos de la cellule.
  9. Mettre l’amplificateur en mode VC (clampage de tension).
  10. À l’aide du logiciel pCLAMP (Molecular Devices Corp., Sunnyvale, CA), fixer la cellule à un potentiel membranaire prédéfini. Celui-ci peut être soit la valeur du potentiel de repos mesuré précédemment (pour l’enregistrement en l’absence de courant membranaire), soit toute autre valeur de potentiel d’essai souhaitée. Veiller à l’amplitude et à la stabilité du courant de fuite (en l’absence de K+/Rb+/Li+), qui, selon une règle générale, ne devrait pas dépasser -200 nA à -30 mV.
  11. Perfuser l’ovocyte pendant une durée déterminée (par exemple 3 min pour la Na+,K+-ATPase) avec une solution contenant du Rb+ (afin d’obtenir un courant maximal, utiliser des concentrations saturantes déterminées par des mesures de flux en conditions non clampées) et enregistrer le courant de la pompe avec le logiciel pCLAMP en mode enregistrement continu. S’assurer que l’absorption de Rb+ est complètement interrompue par la suite en perfusant la cellule avec une solution dépourvue de Rb+ pendant 30 secondes.
    1. Arrêter l’expérience de clampage de tension à deux électrodes, retirer l’ovocyte de la chambre d’enregistrement et passer à l’étape de lavage 4 du paragraphe « Expériences d’absorption de Rb+ » pour analyser l’absorption de Rb+ par spectrophotométrie d’absorption atomique.
  12. Effectuer la soustraction du courant de décalage et évaluer l’intégrale temporelle du courant de la pompe à l’aide du programme Clampfit du logiciel pCLAMP.

9. Mesures de l'absorption de Rb+

  1. Couper et faire fondre l'extrémité jaune d'une pipette sur une pipette de 200 μl pour obtenir un diamètre d'environ 2 mm. L'utilisation de telles pointes garantit un transfert minimal de solution lorsque les ovocytes sont déplacés entre les boîtes d'incubation ou de lavage. Faire fondre brièvement la pointe à la flamme d'un briquet de poche. Cette étape de polissage évite d'endommager les ovocytes.
  2. Préparer, pour chaque ovocyte à mesurer, un tube Eppendorf de 1,5 ml rempli de 1 ml d'eau Millipore. Disposer trois boîtes de Pétri contenant du tampon de lavage sans Rb+ (par exemple PLB) et une contenant de l'eau Millipore.
  3. Transférer simultanément cinq ovocytes préincubés dans une boîte de Pétri de 3,5 cm remplie de tampon de flux de Rb+ (concentrations de 0 à 15 mM Rb+) et incuber pendant 3 min (Na+,K+-ATPase) ou 15 min (H+,K+-ATPase) sous contrôle thermique (par exemple 21 °C dans une pièce climatisée ou sur une plaque chauffante).
  4. Transférer simultanément les ovocytes dans la première boîte contenant le tampon de lavage sans Rb+ (dans le cas de la Na+,K+-ATPase, le PLB peut être utilisé). Il est impératif que les écarts entre les durées d'incubation soient inférieurs à 5 secondes. Rincer délicatement.
  5. Déplacer les ovocytes dans la deuxième puis la troisième boîte contenant le tampon de lavage sans Rb+, rincer délicatement.
  6. Transférer les ovocytes dans la boîte contenant de l'eau Millipore, rincer délicatement.
  7. Transférer chaque ovocyte individuellement dans l'un des tubes Eppendorf préparés contenant 1 ml d'eau Millipore.
  8. Homogénéiser l'ovocyte en aspirant et en expulsant plusieurs fois à l'aide d'une pointe de pipette de 200 μl jusqu'à ce que la solution devienne uniformément trouble.

10. Préparation de l'Analyste 800 utilisant le système de four THGA

  1. Ouvrir la vanne du gaz inerte requis (argon) et insérer une lampe à cathode creuse appropriée (lampes à cathode creuse monovalentes pour Li+ ou Rb+ ; Photron, Melbourne, Australie) dans une position de douille arbitraire.
  2. Démarrer le logiciel de contrôle WinLab32 (Perkin Elmer) et allumer la lampe à cathode creuse appropriée. Les lampes à cathode creuse Perkin Elmer Lumina sont reconnues automatiquement et apparaissent dans la liste de sélection. Les lampes à cathode creuse non compatibles doivent être saisies manuellement.
  3. Prévoir un temps de préchauffage d’environ 10 à 15 minutes pour permettre l’équilibration des lampes.
  4. Vérifier visuellement que le tube THGA (tube d’atomiseur graphite chauffé transversalement, Perkin Elmer, #B3000641) est en bon état. Les fours THGA doivent être remplacés tous les 300 tirs (durée de vie moyenne indiquée par le fabricant), mais peuvent souvent supporter un nombre plus élevé d’échantillons.
  5. Sélectionner la technique « four THGA » dans WinLab32.
  6. Préparer au moins cinq échantillons d’étalonnage avec des concentrations en Rb+/Li+ comprises entre 10 et 50 μg/L (par exemple par dilution appropriée à partir d’une solution de RbCl ou de LiCl à 1 M) et un témoin contenant uniquement de l’eau Millipore. Remarque : les sels doivent être de la pureté la plus élevée disponible (« puriss. » ou provenant d’étalons commerciaux pour AAS).
  7. Choisir le fichier d’initialisation approprié (appelé fichier « méthode », qui fait référence aux paramètres d’étalonnage et charge les réglages de l’instrument, par exemple la longueur d’onde de détection en AAS ; les longueurs d’onde pour Rb+ et Li+ sont respectivement 780 nm et 670,8 nm), puis saisir les positions et concentrations des échantillons d’étalonnage. Pour cela, sélectionner l’autosampler approprié (plateau d’échantillonnage avec 88 ou 148 positions pour l’appareil AAnalyst 800).
  8. Mesurer la courbe d’étalonnage.
  9. Transférer maintenant chaque homogénat d’oocyte dans des godets d’échantillonnage individuels en polypropylène de 1,2 ml (Perkin Elmer, #B0510397) et placer ces tubes dans le plateau de l’autosampler.
  10. Créer un fichier d’information sur les échantillons afin d’identifier les prélèvements dans les positions de l’autosampler, régler ensuite le volume d’échantillon à 20 μl, puis démarrer l’appareil.
  11. À la fin de l’analyse (ou lors d’un contrôle visuel toutes les heures pour des séries longues d’échantillons), vérifier les prélèvements dont la quantité mesurée de Rb+ dépasse le maximum de la courbe d’étalonnage. Dans ce cas, diluer les échantillons concernés de manière appropriée et les mesurer à nouveau.

11. Remarques pour la mesure de grands nombres d'échantillons (supérieurs à 50)

  • Pour une analyse nocturne de l'instrument, il est recommandé de remplir le réservoir de l'auto-échantillonneur avec de l'eau Millipore afin de prévenir l'évaporation des homogénats dans les tubes à essai.
  • Il est recommandé de placer un tube à essai contenant 2 % d'HNO3 entre chaque série de 20 échantillons afin d'éviter l'obstruction de la capillaire d'injection de l'auto-échantillonneur.

Protocole de température recommandé pour le rubidium par THGA-AAS

ÉtapeTempérature (°C)Durée de rampe (sec)Durée de maintien (sec)Débit de gaz argon (ml/min)
Séchage 1110120250
Séchage 2130530250
Pyrolyse300-6001020250
Atomisation1700-1800050
Nettoyage240012250

Protocole de température recommandé pour le lithium par THGA-AAS

ÉtapeTempérature (°C)Durée de rampe (sec)Durée de maintien (sec)Débit de gaz argon (ml/min)
Séchage 1110130250
Séchage 21301530250
Pyrolyse9001020250
Atomisation2200050
Nettoyage245013250

Analyse des données

  1. Pour chaque condition de mesure, calculez la prise moyenne de Rb+. Le spectrophotomètre AAS fournit des valeurs en μg/L, qu'il faut convertir en pmol/oocyte/min.
  2. Pour les analyses cinétiques (valeurs apparentes de KM), soustrayez la prise de Rb+ de fond déterminée à partir des ovocytes contrôles non injectés du même lot, à la concentration donnée de RbCl.
  3. Tracez les données à l'aide du logiciel Origin et appliquez un ajustement selon une fonction de Hill Formule de l'équation de Hill ; diagramme de cinétique biochimique ; analyse de l'affinité de liaison ; substrat enzymatique. ou selon une fonction de Michaelis-Menten Équation de cinétique enzymatique ; formule A = Amax[S]/(K0,5 + [S]) ; concept de biochimie.. Dans ces équations, [S] représente la concentration en substrat, nH le coefficient de Hill, et K0.5 la concentration en substrat nécessaire pour une activation à moitié maximale.

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Résultats

La quantification de l'absorption de Rb+ par les ATPases de type P qui assurent le contre-transport de K+ (ou de Rb+) au moyen de la spectroscopie d'absorption atomique dans le système d'expression de l'oocyte de Xenopus permet une détermination fiable des paramètres cinétiques de l'enzyme.

Détermination de la stœchiométrie du transport de la Na+/K+-ATPase

Pour la Na+/K+-ATPase électr...

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Discussion

La méthode décrite pour mesurer la quantité de Rb+ (ou Li+) absorbée dans les ovocytes individuels de xénope exprimant Na+, K+- ou H+,K+-ATPase s’est avérée être une technique polyvalente, flexible et précise pour déterminer les paramètres cinétiques ou thermodynamiques du transport des ATPases de type P1,4,5,7,8. Il s’agit d’une alternative sûre et fiable aux tests de flux de traceurs radioactifs, et permet de répondre à un large évent...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Remerciements

Les auteurs remercient Ernst Bamberg (Max-Planck-Institute of Biophysics, Francfort, Allemagne) pour son généreux soutien pendant la phase initiale de développement de la méthode, Kazuhiro Abe (Université de Kyoto, Japon) pour les nombreuses discussions fructueuses et le Dr Michael Kohl (Analytik-Service, Woltersdorf, Allemagne) pour le soutien technique. Les auteurs remercient chaleureusement la Fondation allemande pour la recherche DFG (Cluster of Excellence « Unifying Concepts in Catalysis »), qui a également financé l’appareil Perkin Elmer AAnalyst 800 (SFB 498).

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Matériaux

produit
Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
4.0 Ethicon Vicryl Suture
PCR haute puretéRoche Applied Science11732676001
Eau sans nucléaseAmbionAM9937
T7Ambion1340, 1344
Ouabain octahydratéSigma AldrichO3125
Tricaïne (sel de méthanesulfonate d’éthyle 3-aminobenzoate)Sigma AldrichA5040
Inhibiteur de la trypsine de type III-O à partir du blanc d’œuf de pouleSigma AldrichT2011
SCH28080Sigma AldrichS4443
AAnalyst 800Perkin Elmer0993-5256
WinLab32TMPerkin Elmer
Eppendorf6131 000.012
Capillaires en borosilicateScience ProductsGB150F-8P
Tubes d’hématocrite 3.5"Drummond Scientific3 000-203-G/X
Lampe à cathode creuse LithiumPhotronP929LL
Lampe à cathode creuse RubidiumPhotronP945
Extracteur de micropipette NarishigeModèle PC-10
Chambre d’enregistrement d’ovocytes RC-10Warner Instr.W4 64-0306
Nanoject II Pompe d’injectionDrummond Scientific3-000-204
Logiciel pCLAMPDispositifs moléculaires Gobelet
d’échantillon en polypropylène (1,2 ml)Perkin ElmerB0510397
Speedvac - Concentrateur modèle 5301Eppendorf5301 000.210
Tube THGAPerkin ElmerB3000641
Turbo TEC-10CX AmplificateurNPI ElectronicsTEC-10CX
><> mMessage mMachine Kit SP6/ BioPhotomètre

Références

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