Article de méthode

L'angiogenèse dans le poumon de rat ischémique

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DOI :

10.3791/50217

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8 février 2013

 , 
1Johns Hopkins Asthma and Allergy Center, Division of Pulmonary and Critical Care Medicine, Johns Hopkins University

Dans cet article

Résumé

Le poumon est perfusé à la fois par l'artère systémique bronchique et les artères pulmonaires. Dans la plupart des pathologies pulmonaires, il est le plus petit système vasculaire systémique qui montre une néovascularisation robuste. Interruption du flux sanguin pulmonaire favorise l'angiogenèse bronchique rapide. Nous fournissons des détails chirurgicales pour induire une ischémie artérielle pulmonaire gauche qui favorise la néovascularisation bronchique.

Résumé

Le poumon est perfusé adulte fois par l'artère systémique bronchique et le retour veineux entier passant à travers les artères pulmonaires. Dans la plupart des pathologies pulmonaires, il est le plus petit système vasculaire systémique qui répond à un besoin de la perfusion pulmonaire améliorée et montre une néovascularisation robuste. Pulmonaire ischémie vasculaire induite par obstruction de l'artère pulmonaire a été montré pour entraîner rapidement l'angiogenèse artérielle systémique chez l'homme ainsi que dans plusieurs modèles animaux. Bien que l'évaluation histologique de l'évolution temporelle de la prolifération artère bronchique chez le rat a été minutieusement décrite par Weibel 1, les mécanismes responsables de cette croissance organisée de nouveaux navires ne sont pas claires. Nous fournissons des détails chirurgicales pour induire une ischémie artérielle pulmonaire gauche chez le rat qui mène à la néovascularisation bronchique. Quantification de l'ampleur de l'angiogenèse présente une difficulté supplémentaire due à la présence des deux lits vasculaires dans le poumon. Méthodespour déterminer l'angiogenèse fonctionnelle basée sur des injections de microsphères marquées sont fournis.

Introduction

Angiogenèse systémique dans le poumon est bien reconnu. Dans des états pathologiques tels que l'asthme 2, la fibrose pulmonaire interstitielle 3, le cancer 4 et chronique thrombo-embolie pulmonaire 5, le système vasculaire systémique dans et autour des poumons prolifère et envahit le parenchyme pulmonaire. Cependant, les modèles animaux pour étudier cette activation différentielle de la systémique plutôt que de la circulation pulmonaire sont peu nombreux. Peut-être le modèle le plus reproductible de la néovascularisation systémique dans les poumons du mammifère adulte est celui qui se produit après l'induction de l'ischémie chronique artère pulmonaire. La réponse à obstruction de l'artère pulmonaire gauche chez l'homme 5-7, chiens 8, 9, porcs moutons 10, 11, cochons d'Inde rat 1, 12, 13, et les souris 14 est la prolifération rapide de l'artère bronchique ainsi que les artères intercostales. Les mécanismes responsables de la systémique neovascularition du poumon après une ischémie pulmonaire sont en grande partie inconnus et n'ont pas été largement étudiée. L'évolution dans le temps de l'angiogenèse bronchique chez le rat après obstruction de l'artère pulmonaire gauche a été soigneusement décrit dans l'ouvrage histologique de Weibel 1. L'extension de ce travail chez le rat, notre laboratoire a mis l'accent sur deux facteurs de croissance importants dans ce processus ainsi que le résultat physiologique de cette néovascularisation dans les poumons. Les résultats démontrent la chimiokine CXC CINC-3 est élevée peu de temps après l'ischémie et le traitement des rats avec un anticorps neutralisant CXCR2, le récepteur de CINC-3, atténue l'angiogenèse 13. La vascularisation nouvellement créé bronchique 14 jours après le début de l'ischémie pulmonaire s'est avérée anormale de protéines avec une perméabilité sensiblement augmenté 15. Fonction pulmonaire gauche n'était pas normale projection diminué la capacité de diffusion et une diminution du volume pulmonaire dans 15. Bien que la néovascularisation peut avoir contributed à la préservation du tissu pulmonaire lors d'une ischémie pulmonaire chronique, il ne semble pas être normale et peuvent contribuer à une diminution soutenue de la fonction pulmonaire.

Peut-être l'un des aspects les plus curieux de ce modèle tient à la répartition spatiale de la prolifération des vaisseaux sanguins. Malgré la libération de facteurs de croissance dans le parenchyme pulmonaire due à une ischémie, la néovascularisation provient de relativement grandes artères bronchiques en amont. L'artère bronchique normale se pose comme une petite branche de l'aorte et envahit l'arbre bronchique à la carène. Ainsi, le mécanisme par lequel les facteurs de croissance induisent la phase initiale de artériogenèse n'est pas claire. Nous suggérons que le rat, avec une anatomie vasculaire semblables aux humains, offre une occasion unique d'étudier les mécanismes responsables de l'angiogenèse systémique durant l'ischémie pulmonaire. Bien que l'obstruction complète de l'artère pulmonaire gauche est un phénomène rare chez les sujets humains,augmenté vascularisation bronchique semble être également induite chez les patients quel que soit le site et la taille de l'obstruction de l'artère pulmonaire 16. Ainsi, nous donnons une description détaillée de l'approche chirurgicale pour ligaturer l'artère pulmonaire gauche chez le rat et un moyen de quantifier l'ampleur de l'angiogenèse.

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Protocole

Tous les protocoles menées chez le rat ont été approuvés par les soins de la Johns Hopkins University et animaux comité sur l'utilisation et conformément aux directives du NIH. Chaque fois que possible, l'animal devrait être préparée chirurgicalement dans une zone séparée de la zone chirurgicale pour minimiser la contamination du site opératoire.

1. Anesthésie / analgésie

  1. Lieu rat (rats Sprague-Dawley mâles, 125-150 G, Harlan, Indianapolis, IN) dans une chambre d'induction infusé avec 3% d'isoflurane.
  2. Placez rat anesthésié à bord chirurgie attaché à cône de nez et d'un ventilateur avec un anesthésique isoflurane 3%. Utiliser une technique stérile pour toutes les procédures. Drapé rat afin d'assurer champ opératoire stérile.

2. Intubation

  1. Immobiliser appendices en décubitus dorsal à l'aide du ruban adhésif chirurgical.
  2. Retirer rat de cône de nez, de prolonger la langue avec des pinces rembourrées.
  3. Utiliser 14 intracath jauge avec stylet métallique émoussé comme guide. Faites glisser derrière pourNgue, dans la trachée.
  4. Retirer stylet de métal blanc en laissant intracath en plastique dans la trachée. Assurer le rat est la respiration et de l'air s'écoule à travers le tube.
  5. Remplacer cône de nez avec adaptateur directement au cathéter, connectez-rat pour ventilateur (90 respirations / min; 8 ml / kg volume courant; rongeurs Ventilateur Modèle 683, Harvard Apparatus, Holliston, Massachusetts).
  6. Appliquer Puralube (Butler Schein, Dublin, OH) pommade vétérinaire sur les yeux.

3. Thoracotomie

  1. Côté rat bon endroit bas, immobiliser appendices à l'aide du ruban adhésif chirurgical.
  2. Raser la cage thoracique gauche côté.
  3. Retirer l'excédent avec de la fourrure petit vide.
  4. Assurez-champ stérile en l'essuyant avec de l'alcool suivie de povidone-iode tige montée (Dynarex Corporation, Orangebur, État de New York). Répétez ce processus deux fois plus (pour un total de trois gommages).
  5. Faire une incision transversale avec ciseaux de dissection stériles ou stériles scalpel au centre du terrain.
  6. Blunt disséquer à travers layers du tissu et de la graisse vers le bas pour les côtes (dernière couche est une membrane mince couvrant les côtes).
  7. Compter les côtes de déterminer 3 ème espace intercostal.
  8. Utilisation stériles 45 ° Graefe forceps, l'incision franche entre les 3 e et 4 e côte.
  9. Insérer des séparateurs côtes, tirez doucement la création de vide ouvert avec une visualisation complète du poumon, bande endroit des sutures de maintenir ouverte.

4. Gauche ligature de l'artère pulmonaire

  1. Avec 90 ° Graefe pince, déplacez poumon gauche vers l'arrière avec la main droite.
  2. Utilisant le modèle Dumont # 5 pinces droites, prenez l'artère pulmonaire gauche et des voies respiratoires avec la main gauche. L'artère pulmonaire gauche se poser sur le dessus des voies respiratoires. Assurez-vous que le forceps sont directement perpendiculaire à la table. En outre, il est plus efficace pour ramasser l'artère pulmonaire gauche / bronche souche gauche à la position la plus distale (la plus proche du parenchyme). Poussez le poumon gauche ventilation de côté à cette manœuvre à la main gauche.
  3. Utilisez Dumontle motif n ° 5 45 ° pinces courbées pour séparer l'artère pulmonaire gauche de la bronche souche gauche à leurs frontières naturelles. Cette ligne de séparation apparaît mince et blanc entre les deux structures individuelles.
  4. Séparer directement sous artère sans passer par le récipient; glisser doucement les extrémités de la pince tenues ensemble le long de la séparation.
  5. Continuez jusqu'à ce que des conseils de forceps ont visiblement séparée de l'artère pulmonaire gauche et la bronche souche gauche. Seul un petit point de la pointe doit être pleinement travers. Si le sang peut être visualisée sur le bout de la pince, il n'est pas complètement à travers et ligature ne doit pas être tentée. Une fois dans l'espace, l'artère pulmonaire gauche jettera sur la courbe de la pince. Maintenir dans cette position.
  6. Relâchez doucement droite émoussée poignée de pince (main gauche) et prenez pièce d'une suture pré-coupé (~ 2-3 cm, taille suture en polypropylène 6-0; Myco médicaux, Cary, NC).
  7. Ouvrez une pince courbes berçant l'artère pulmonaire gauche et gsuture rab. Tirez doucement suture à travers l'espace entre l'artère pulmonaire gauche et bronche souche gauche dans un mouvement vers le haut par rapport à la courbe de la pince.
  8. Attachez l'occlusion pulmonaire gauche avec un noeud carré, reste soigneusement snip de suture.
  9. Fermer côtes en utilisant le forceps émoussé de tenir côte et la suture à deux reprises avec le polypropylène (monofilament bleu) taille 4-0 attaché à un 19 mm, arrière cercle 3/8 aiguille coupante (Myco médicale, Cary, NC) dans une pince hémostatique, en faisant attention de ne pas la peau de suture (seulement côtes).
  10. Remplissez un noeud lâche carré, gonfler les poumons, lieu expiratoire positive de pression (PEEP; 2-5 cmH 2 O), hyperinflate noeud du poumon puis fixez solidement, et faire un autre nœud complet avant la biopsie reste de suture. Retirer de la PEEP et de visualiser pendant 30 secondes pour que le poumon ne s'effondre pas. Appliquer 5 gouttes bupivicaïne (APP Pharmaceuticals, Schaumbur, IL).
  11. Fermer peau en plaçant colle tissulaire sur la plaie et la peau pousser ensemble à l'aide de retour end de coton-tige. Donnez bupivicaïne (2,0 mg / kg sous-cutané) sur le site de l'incision puis tous les 8 heures, pendant 24 heures ou jusqu'à ce que l'animal reprend son activité normale. Comme la couche sous-cutanée dans ce domaine est très mince, il n'est pas facile de suture sur son propre. Lorsque l'on applique de la colle tissulaire et la peau est poussé en même temps qu'il ferme également la couche sous-cutanée.
  12. Coupez le gaz isoflurane, mais continuer à ventiler le rat pendant 1-2 min à l'air ambiant jusqu'au retour de mouvements volontaires. Débranchez le tube trachéal du ventilateur et s'assurer que le rat respire spontanément avant de le retirer.
  13. Essuyez Puralube des yeux avec un coton-tige et le mouvement du moniteur et de récupération. Injecter chlorhydrate de buprénorphine (0,05 mg / kg par voie intrapéritonéale, Butler Schein, Dublin OH). Continuer livraison des analgésiques toutes les 12 heures pendant 48 heures après la chirurgie.

5. Cathétérisme artère carotide gauche

Pour évaluer l'ampleur de perfus bronchiquesion du poumon gauche ischémique à des moments souhaités après ligature de l'artère pulmonaire gauche, injecter microsphères marquées par l'artère carotide gauche dans la crosse de l'aorte. Préparer les rats comme ci-dessus 1-2.

  1. Couper la ligne médiane le long cou, émousser décortiquer pour révéler la trachée artère carotide gauche et (site d'injection des microsphères).
  2. Insérez cathéter rempli de sérum physiologique hépariné, pointe émoussée du tube PE20 (Becton Dickinson, Sparks MD) dans le récipient relié à aiguille de 25 g, 4-way robinet, seringue de 1 ml.
  3. Placez la bouteille de microsphères (15 um pourpre polystyrène microsphères fluorescentes, 1 x 10 6 / ml sphères; Invitrogen, Eugene, OR) dans sonicateur l'eau pendant 30 secondes.
  4. Retirez la bouteille, vortex et d'en tirer une hausse de 0,5 ml (500.000 microsphères) dans un 1 ml Hamilton seringue en verre (Hamilton Company, Reno, NV) à travers une aiguille de 20 g.
  5. Fixez une seringue Hamilton à 4 voies robinet et laisser infuser microsphères avec pompe seringue (taux: 500 pi / min; Génie De plus, Kent scientifique, Torringtsur, CT).
  6. Retirer la seringue Hamilton et appareils de chasse d'eau avec 1 ml de solution saline heparized à 500 l / min.
  7. Effectuer une thoracotomie coffre plein et être exsangue le rat en coupant la veine cave inférieure.
  8. Retirez le poumon gauche et d'autres tissus d'intérêt.
  9. Pour extraire les microsphères à partir de tissus, de prendre tout le poumon gauche du rat après saignée et le placer dans KOH 2M (4-6 ml). Placer dans un bain d'eau à 55 ° C et laisser une nuit à la digestion des tissus. Ajouter Tween 80 (0,25%) pour laver les billes, vortex (10 sec) et centrifuger (2,000 rpm, 20 ° C pendant 10 minutes). Retirer le surnageant, ajouter le 2-éthoxyéthyle (1 ml), vortex et laisser reposer pendant 1 heure. Vortex et centrifuger la suspension (2.000 rpm; (20 ° C pendant 10 min) Retirer la couche d'acétate de 2-éthoxyéthyle aqueuse contenant de la fluorescence, dans une cuvette de mesure et en utilisant un Hitachi F-2500 spectrophotomètre à fluorescence (618 612/emission excitation. , Digilab, Holliston, MA).

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Résultats

Fonte vasculaire: résultats des effets de l'ischémie artère pulmonaire gauche chez le rat sont représentés dans la figure 1. Montré est un méthacrylate coulé de la vascularisation bronchique et la vascularisation extensive de l'arbre bronchique gauche 28 jours après LPAL. Pour obtenir cette distribution, le système vasculaire systémique a été injecté avec un mélange de méthacrylate (rouge), rétrograde dans l'aorte descendante et la trachée est canulée et injecté avec un matériau à base de si...

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Discussion

Gauche ligature de l'artère pulmonaire chez toutes les espèces étudiées conduit à une néovascularisation systémique robuste du poumon ischémique. Nous avons présenté les détails de l'approche chirurgicale chez un modèle de rat. Nos résultats produit par coulée vasculaire, histopathologie, et le marquage in vivo montrent que la prolifération artères bronchiques et perfuser le parenchyme pulmonaire. Ainsi, les mécanismes de l'angiogenèse bronchique peut être étudiée dans un modèle animal qui ...

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Déclarations de divulgation

Aucun conflit d'intérêt déclaré.

Remerciements

Nous reconnaissons le travail du Dr Adlah Sukkar, MD en aidant à la coulée du poumon. Ce travail a été financé par le NHLBI, HL088005.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Réactifs: Entreprise
chlorhydrate de buprénorphine, Puralube Butler Schein
bupivicaïne APP Pharmaceuticals
Povidone-iode tige montée Dynarex Corporation
taille suture en polypropylène 6-0, 3/8 cercle d'aiguilles inverse de coupe Myco médicale
PE20 tube Becton Dickinson
15 pm fluorosphères en polystyrène pourpre Invitrogen
1 ml Hamilton seringue en verre Entreprise Hamilton
Equipement:
Pompe à seringue Genie plus Kent scientifique
Spectrophotomètre à fluorescence Digilab
Rongeur Ventilateur Modèle 683 Harvard Apparatus
Tableau 1. Tableau de réactifs spécifiques et de l'équipement.

Références

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Mots-clés

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