Électrotaxie microfluidique à base d'analyse quantitative à la demande de Caenorhabditis elegans 'Locomotion

Summary

Procédé de micro-électro-fluidique semi-automatisé pour induire à la demande dans la locomotion Caenorhabditis elegans Est décrite. Cette méthode est basée sur le phénomène neurophysiologique de vers répondant à des champs électriques légers («électrotaxie") à l'intérieur des canaux microfluidiques. Microfluidique électrotaxie sert d'une technique rapide, sensible, faible coût, et évolutive pour dépister les facteurs affectant la santé neuronale.

Abstract

Les Caenorhabditis elegans nématode est un modèle polyvalent organisme pour la recherche biomédicale en raison de sa conservation de gènes et les voies liées à la maladie ainsi que sa facilité de culture. Plusieurs C. modèles de maladies elegans ont été signalés, y compris les maladies neurodégénératives telles que la maladie de Parkinson (PD), ce qui implique la dégénérescence des dopaminergiques (DA) des neurones ^1. Les deux transgènes et des produits chimiques neurotoxiques ont été utilisés pour induire DA neurodégénérescence et les anomalies de mouvement conséquente vers, permettant des enquêtes sur la base de la neurodégénérescence et les écrans des gènes et des composés ^2,3 neuroprotecteurs.

Écrans chez les eucaryotes inférieurs comme C. elegans fournir un moyen efficace et économique pour identifier les composés et les gènes affectant la signalisation neuronale. Écrans classiques sont généralement effectuées manuellement et marqués par inspection visuelle, par conséquent, ils sont contre-tempsuming et sujettes à des erreurs humaines. En outre, la plupart se concentrent sur l'analyse du niveau cellulaire tout en ignorant locomotion, qui est un paramètre particulièrement important pour les troubles du mouvement.

Nous avons développé un système de criblage microfluidique roman (Figure 1) qui contrôle et quantifie C. La locomotion elegans de l'aide stimuli de champ électrique à l'intérieur de microcanaux. Nous avons montré qu'un champ courant continu (CC) peut induire robuste sur demande locomotion vers la cathode ("électrotaxie") ^4. Inversion de polarité du champ entraîne le ver à inverser rapidement la direction ainsi. Nous avons également montré que les défauts dans les neurones sensoriels et d'autres dopaminergiques modifier la réponse de natation ^5. Par conséquent, des anomalies dans la signalisation neuronale peuvent être déterminées en utilisant locomotion comme une lecture. La réponse du mouvement peut être quantifiée avec précision en utilisant une gamme de paramètres tels que la vitesse de nage, le corps fréquence de flexion et temps d'inversion.

4. Ces résultats nous ont amenés à concevoir un nouveau dispositif microfluidique pour trier passivement vers l'âge et le phénotype ^6.

Nous avons également testé la réponse des vers à impulsions DC et courant alternatif champs électriques (AC). Champs continus pulsés de différents cycles efficacement électrotaxie générés à la fois C. elegans et sa cousine C. briggsae ^7. Dans une autre expérience, symétriques champs AC avec des fréquences allant de 1 Hz à 3 kHz immobilisés vers l'intérieur du canal ^8.

Mise en oeuvre du champ électrique dans un environnement microfluidique permet une exécution rapide et automatique du dosage électrotaxie. Cette approche promet de faciliter les écrans génétiques et chimiques à haut débit pour les facteursaffectant la fonction neuronale et la viabilité.

Protocol

1. Photolithographie pour Mold Maître Fabrication

1. Baigner un 3 pouces plaquette de silicium dans de l'acétone pendant 30 sec, puis le méthanol pendant 30 sec. Rincer avec dH ₂ 0 eau pendant 5 min.
2. Sécher la surface de la plaquette avec un pistolet à air de N2. Chauffer la tranche sur une plaque chauffante à 140 ° C pendant 2 min.
3. Plasma oxyder la surface de la tranche de silicium (1 min, 50 W).
4. Spin-coat surface de la plaquette avec 3 ml SU-8 100 photosensible (40 sec; 1,750 rpm).
5. Pré-cuire la plaquette revêtue sur une plaque chauffante à 65 ° C pendant 10 min, puis la rampe la température jusqu'à 95 ° C en 2 minutes. Maintenir ce réglage pour un montant supplémentaire de 1 h.
6. Aligner un masque photographique contenant la conception du canal désiré. Exposer la résister à 550-600 mJ / cm ² de lumière UV (350-400 nm). Masques peuvent être conçus dans AutoCAD et imprimés sur un transparent avec impression haute résolution.
7. Post-cuire la galette sur une plaque chauffante à 65 ° C pendant 1 min et 95 ° C pendant 10 min, rampe til température comme avant.
8. Plonger la plaquette dans la solution de révélateur SU-8 pendant 10-15 min. Vérifiez achèvement du développement d'un rinçage avec de l'isopropanol. Si un précipité blanc apparaît, continuer à développer. Le moule maître est représenté sur la figure 2A.

2. Lithographie douce pour Fabrication Microchannel

1. Mélanger 35 ml de polydiméthylsiloxane (PDMS) de la base d'élastomère avec 3,5 ml PDMS agent de durcissement.
2. Placez le moule maître fabriqué (modèle vers le haut) et une plaquette de silicium vierge dans des boîtes de Pétri recouverte de papier d'aluminium.
3. Verser 20 ml prépolymère PDMS dans le plat du moule maître et de 15 ml dans le second plat. Éliminer les poches d'air sous les plaquettes en appuyant doucement sur eux avec un applicateur jetable en bois.
4. Couvrir les deux plats et mettre de côté pour un jour à guérir. Sinon, pour un durcissement plus rapide, éliminer les bulles d'air du PDMS en utilisant un dégazeur à vide et ensuite laisser les plats sur une plaque chauffante à 80 ° C pendant 2hr.
5. Retirez le film et le zeste du PDMS à partir des plaquettes.
6. Utilisez le Harris Uni-Core (2,5 mm) pour percer des orifices d'accès de fluide aux deux extrémités de la chaîne. Couper le canal et blanc PDMS en bandes de taille similaire.
7. Charger le canal, la bande ébauche PDMS et d'une lame de verre (75 x 25 mm ²⁾ dans un dispositif d'oxydation par plasma, probablement situé dans une salle blanche. Exposer à un plasma d'oxygène pendant 40 secondes à 40 W de puissance.
8. Coller le morceau de canal et lame de verre à faces opposées de la bande ébauche. Mettez de côté pendant 2 heures pour achever le collage.
9. Placez l'ensemble sur une plaque chauffante à 120 ° C. Fixer le tube en plastique (diamètre intérieur 1/32 ", diamètre extérieur de 3/32"), chacun au moins 6 po de long, les réservoirs percés à l'aide de PDMS prépolymère. Fixer un raccord en plastique fluidique à un ou deux tubes pour permettre la fixation de la seringue, ou utiliser des raccords disponibles dans le commerce.
10. Laisser le PDMS fixer le tube à guérir. Insérez 3 "longueurs de calibre 22 fil de cuivre isolé dans each réservoir, entre le tube d'admission et le canal, et sûr PDMS prépolymère. Le produit fini est illustré à la figure 2B.

3. Électrotaxie Experiment

1. Placer le microcanal sur la scène (de préférence XY mobile) d'un microscope avec une caméra montée reliée à un moniteur (Figure 1).
2. Connectez l'alimentation ou les fils de sortie de l'amplificateur à des électrodes de la microcanaux. Une alimentation CC simple est suffisant, si seulement un signal de courant continu est souhaité, mais un amplificateur connecté à un générateur de fonction permet à l'application de courant continu à impulsions et des signaux alternatifs de même.
3. Fixer le tuyau de sortie du micro-canal à une seringue jetable. Immerger l'embouchure du tube d'entrée dans un tampon physiologique, M9 et doucement aspirer du liquide dans le canal par application d'une pression négative à l'intérieur de la seringue (soit manuellement, soit en utilisant une pompe à seringue). Lorsque les tubes d'entrée et de sortie sont tous deux remplis de M9, déconnecter la seringue from le tube. Niveler les deux tubes à la même hauteur pour empêcher l'écoulement hydrostatique entraînée.
4. Appliquer une tension de courant continu sur le canal et faire en sorte que la résistance (R = U / I) est d'environ 0,6 MQ (pour une longueur de 50 mm, 0,3 mm de largeur et d'environ 0,1 mm de profondeur à microcanaux).
5. S'il est satisfait de l'intégrité de la chaîne, suivez les étapes ci-dessus pour charger les vers d'une suspension diluée dans le canal.
6. Déconnecter la seringue et hydrostatique manipuler le flux de réglage de la hauteur par rapport aux tubes d'. Utilisez cette méthode pour mettre un ver dans le centre du chenal et puis posez les deux tubes plats à la même altitude.
7. Régler l'alimentation sur la tension appropriée: 4-12 V / cm pour les animaux de scène L3, 4-10 V / cm pour L4s et 2-4 V / cm pour les jeunes adultes. Activez le signal électrique et permettre 1 min de pré-exposition pour le ver de s'acclimater au terrain. Le ver devrait commencer à se déplacer vers la cathode. Lorsque la minute est passée, utiliser l'appareil photo pour commencer l'enregistrement.
8. Pour AC et le poulsd expériences DC, le champ électrique en réponse au maximum peut être adoptée de cycle du signal ci-dessus et de la fréquence et de service peuvent être modulées à volonté ^{7, 8.}
9. Quand l'expérience est terminée, retirer tout le liquide (et vers) du canal, le rincer avec dH ₂ 0, et laisser l'appareil sur une plaque chauffante à 125 ° C pour sécher.
10. Extraire des données locomotrices de vidéos enregistrées manuellement à l'aide NIH ImageJ ( http://rsbweb.nih.gov/ij/ ) ou un logiciel de suivi de ver MATLAB basée personnalisé.

Results

Une vidéo représentant des électrotaxie d'un type sauvage jeune adulte nématodes et de sa position et sorties de la vitesse du logiciel de suivi du ver sont présentés dans la vidéo supplémentaire 1 et la Figure 3. Le logiciel d'analyse de mouvement lui-même ne reconnaît pas le sens de la polarité du champ et le moment de l'inversion de polarité, mais plutôt, cette information doit être obtenue à partir de la source vidéo. Cela pourrait être fait en utilisant un signal sonore ou visuel d...

Discussion

Profitant du phénomène comportemental d'abord décrit par Gabel et ses collègues et en s'appuyant sur ​​le travail de manipulation diélectrophorétique de Chuang et ses collègues ^11,12, notre test de électrotaxie microfluidique à base offre une méthode simple, robuste et sensible pour sonder l'activité neuronale dans les vers utilisant le mouvement comme une sortie. L'analyse des paramètres de mouvement permet une comparaison quantitative entre les différents génotypes. La précision de fabricati...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acétone	CALEDON Labs	1200-1-30
Méthanol	CALEDON Labs	6700-1-30
Isopropanol	CALEDON Labs	8600-1-40
SU-8	Microchem Corp.	Y131273	SU-8 100
SU-8 Développeur	Microchem Corp.
92x16mm Boîte de Pétri	Sarstedt	82.1473.001
Sylgard 184 Kit d’élastomère de silicone	Dow Corning		Contient une base en élastomère et un agent de durcissement
Générateur de fonction	Tektronix Inc.		Modèle AFG3022B
Amplificateur	Trek Inc.		Modèle 2210-CE
Pompe à seringue	Harvard Apparatus	70-4506	Modèle 11 ELITE
Plaque chauffante	Fisher Scientific	11675916Q	Modèle HP131725Q