Nous avons développé une méthode simple, fiable et relativement peu coûteux pour l'intubation endotrachéale chez des souris par laryngoscopie directe en utilisant un otoscope avec un 2.0 mm spéculum. Cette technique est atraumatique et peut être utilisé pour des mesures répétées dans des expériences chroniques. Nous trouvons supérieure de trachéotomie ou précédemment rapporté des techniques non chirurgicales.
Un abonnement JoVE est requis pour visualiser ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre période d'essai gratuite.
Article de méthode
Intubation endotrachéale chez des souris
Dans cet article
Résumé
Résumé
Souris, à la fois de type sauvage et transgénique, sont le principal modèle mammifère dans la recherche biomédicale pour le moment. Intubation et la ventilation mécanique sont nécessaires pour des expériences animales entières qui nécessitent une intervention chirurgicale sous anesthésie profonde ou des mesures de la fonction pulmonaire. Trachéotomie a été la norme pour l'intubation des voies aériennes chez ces souris pour permettre une ventilation mécanique. Intubation oro-trachéale a été rapportée mais n'a pas été utilisé avec succès dans de nombreuses études en raison de la difficulté technique importante ou une exigence pour l'équipement hautement spécialisé et coûteux. Nous rapportons ici une technique de laryngoscopie directe en utilisant un otoscope équipé d'un 2.0 mm spéculum et l'aide d'un cathéter intraveineux 20 G comme une sonde endotrachéale. Nous avons utilisé cette technique largement et de manière fiable à intuber et procéder à des évaluations précises de la fonction pulmonaire chez la souris. Cette technique s'est avérée sûre, avec pratiquement aucune perte de animal dans des mains expérimentées. De plus, cette techniquepeut être utilisé pour des études répétées de souris dans des modèles chroniques.
Introduction
La souris de laboratoire a supplanté presque toutes les espèces comme le principal modèle mammifère de la biologie et pathobiology. La souris de laboratoire est la plus petite espèce de mammifère qui a été clairement et largement montré pour être de valeur comme un modèle de la maladie humaine et s'est avérée inestimable pour les progrès de notre compréhension de la biologie humaine et la maladie. Le temps de gestation courte et le coût nettement plus faible a permis le développement et l'étude de souris transgéniques nulles et comme un outil banal dans la recherche biomédicale. Toutefois, la taille de la souris de laboratoire moyenne (20-25 g) a limité leur étude dans des études à base physiologique ou chirurgicalement et, par conséquent, certains chercheurs étudient les espèces de mammifères plus grands. Un obstacle à l'utilisation de la souris dans ces études est la difficulté rencontrée avec les techniques d'intubation qui permettraient des mesures physiologiques ou des interventions chirurgicales importantes sous anesthésie profonde. Trachéotomie 1 a été utilisé comme une norme technique la place de l'intubation en raison de la plus grande facilité d'exécution de cette technique et modeste compétence requis. Cependant, la trachéotomie n'est pas propice à des études chroniques ou de récupération chirurgie; ainsi, il est limité à des expériences aiguës. Trachéotomie peut aussi être un facteur de confusion dans la recherche dans laquelle l'inflammation ou réflexes physiologiques sensibles sont importants.
Notre laboratoire a essayé la plupart des techniques décrites par d'autres chercheurs et les a trouvés insuffisants pour une variété de raisons. Trachéotomie est trop traumatisant et induit des saignements et l'inflammation des voies respiratoires. Beaucoup plus problématique est qu'il peut ne pas être faisable répété. Beaucoup de techniques non invasives relativement exigeant un investissement modeste dans les équipements ne sont pas suffisamment fiables. D'autres techniques nécessitent des équipements coûteux qui est difficile à justifier sans savoir si l'équipement fonctionne dans une application spécifique. Ainsi, nous avons cherché à développer une technique non traumatique nécessitant pas plus than un investissement modeste dans l'équipement spécialisé, pourrait être réalisé rapidement et de manière fiable, pourrait être répétée dans les modèles chroniques, et pourrait être utilisé dans un grand nombre d'animaux. Nous rapportons ici une telle technique.
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Protocole
Une. Préparation des animaux
- Obtenir des souris qui sont plus âgés de 8 semaines et plus de 20 g (souris plus petites peuvent être intubés par un expert).
- Anesthésie
- Injecter les souris avec 20 mg / kg, chacune, de la kétamine et de la xylazine par voie intrapéritonéale comme un pré-anesthésique. (Cette dose est insuffisante pour anesthésier complètement la souris, mais facilite le transfert, après l'intubation, ventilation mécanique). Cependant, un ajustement de la posologie peut être nécessaire en fonction de la réponse anesthésique en consultation avec le vétérinaire institutionnel.)
- Induire une anesthésie chez les souris avec 3,5% d'isoflurane / oxygène dans une chambre d'induction de 90 à 120 sec.
- Observez attentivement la fréquence respiratoire. Il devrait ralentir progressivement à pas moins de 45 bpm.
2. Préparation pour intubation
- Débranchez la souris de la chambre d'induction et nuque bien.
- Utilisez une pince fine coussins à gentment étendre la langue de la bouche.
- Maintenir l'extension de la langue en maintenant la langue entre deux doigts et appliquer une force douce.
- Tirez la souris sur le spéculum de l'otoscope avec un mouvement vertical.
- Regardez à travers l'oculaire de l'otoscope tout gommante étroitement et tirez la souris doucement par la langue et la nuque.
- Regardez attentivement pour les cordes vocales. Ils doivent être facilement accessibles à l'heure actuelle. Le aditus de laryngis (la structure de l'ouverture du larynx) devrait paraître relativement blanc. Il devrait y avoir mouvement des cordes à chaque respiration. Si les cordons ne se déplacent pas ou sont mal visualisés, tourner l'animal légèrement et doucement le cou en hyperextension.
- Avec la main dominante, tenez le 20 G, 1 dans le cathéter, d'une longueur de 1 cm de la tubulure PE10 s'étendant à travers l'extrémité du cathéter, comme un crayon et insérez-le dans le côté du spéculum. Le tube PE sert un stylet ou bougie.
- Diriger le tubi de PE10ng (stylet) à travers les cordes vocales et de faire avancer le cathéter 20 G (tube endotrachéale) sur le tube PE jusqu'à ce que le moyeu est au niveau de l'incisive inférieure. Retirer rapidement ce stylet.
- Prendre doucement l'animal hors du spéculum et vérifier l'emplacement du tube en plaçant l'animal sur un ventilateur mécanique continue de 2% d'isoflurane pour maintenir l'anesthésie générale tout au long de l'expérience. Visualisez l'air expiré (bulles) en passant par un piège PEEP pour confirmer l'intubation. Bien que l'intubation oesophagienne peut entraîner quelques bulles, il ne sera pas aussi prononcé ou compatible avec intubation endotrachéale. En outre, observer un tracé de pression des voies aériennes pour les déviations négatives (figure 1). Ceux-ci confirment le positionnement correct du tube. Sinon, placez une petite quantité d'eau dans la tubulure IV et le connecter à la sonde endotrachéale. Vérification de mouvement vers et à partir de la souris avec la respiration 2. Dans le cas d'intubation oesophagienne, la pression traçage va révéler des pressions beaucoup plus élevées et aucun déviations négatives. Bien-expiratoire de CO 2 serait utile, techniquement ce serait très difficile compte tenu des faibles volumes courants (~ 200 pi) et l'équipement pour le faire serait très coûteux. Les techniques simples décrites sont tout à fait suffisante et beaucoup moins cher. Si l'isoflurane n'est pas disponible, toutes les procédures peuvent être menées à l'aide de la kétamine 80-120 mg / kg en association avec la xylazine 10-20 mg / kg pour l'anesthésie générale.
3. Alternative Technique: Direct Laryngoscopie avec la technique otoscope est facilement utilisés à d'autres fins, principalement pour instillation directe de substances d'étude dans le poumon.
- Induire une anesthésie chez les animaux avec de l'isoflurane seul pour cette procédure à 3,5% pour 90 à 120 secondes dans la chambre d'induction.
- Scruff l'animal étroitement à la base du crâne et étendre délicatement la langueavec des pinces fines.
- Tenant doucement la langue, tirez-le vers le haut sur le spéculum (non modifié) jusqu'à ce que l'animal ne peut pas être tiré vers le haut encore.
- Les cordes vocales peuvent être visualisées le plus souvent par cette seule technique, mais tournent l'animal et l'hyper-extension du cou pour les mettre en pleine vue.
- Avancer d'une pipette gel chargement contenant l'instillation de la glotte et instiller le liquide. Parce que le spéculum forme une jonction avec l'hypopharynx la souris aspirer tout liquide résiduel qui ne passe pas à travers les cordes. Ceci est facilement contrôlée par le rhonchorous sons de la souris fait maintenant quand la respiration jusqu'à ce que le fluide est distribué entièrement dans les poumons.
- En variante, un tube PE10 connecter à une seringue de 0,5 ml contenant 50 ul de fluide avec un bol d'air derrière le liquide. Avancer le tube PE attentivement les cordes vocales pour 0,5 cm et décharger le contenu dans les voies respiratoires lentement. Cependant, traumatisme occasionnel voies respiratoires inférieures u se produitchanter cette technique sans une meilleure prestation de l'échantillon.
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Résultats
Intubation avec la technique ci-dessus est fiable et rapide. Le placement approprié de la sonde endotrachéale est plus facilement vérifiée en observant expiré bulles de gaz provenant de la branche expiratoire immergée du du circuit de ventilation (habituellement dans un piège de la PEEP) et déviations négatives sur une pression des voies aériennes traçage (Figure 1). Les déviations négatives sur les voies respiratoires pression traçage sont les plus fiables. D'autres ont utilisé le mouvement d'u...
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Discussion
Dans ce rapport, nous décrivons une technique simple et fiable pour intuber les souris qui est non traumatique et peuvent être utilisés à plusieurs reprises dans le même animal. Cette technique peut être réalisée avec une simple laboratoire ou équipements médicaux qui peuvent être achetés pour une somme modique. La technique de laryngoscopie directe, à l'origine par Hastings et collaborateurs 4, peut également être utilisé pour une variété de buts, mais principalement pour délivrer avec précision les subs...
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Déclarations de divulgation
Les auteurs déclarent qu'ils n'ont aucun intérêt financier concurrents.
Remerciements
Une subvention de mérite du ministère des Anciens combattants et une subvention T32-HL098062 du NHLBI des Instituts nationaux de la santé pris en charge ce travail. Nous tenons à remercier sincèrement les conseils de Randolph H. Hasting, MD, Ph.D. et les conseils et le soutien de l'Unité des médecins vétérinaires du Système de Santé de VA San Diego.
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Tête d’otoscope de commande | Welch Allyn | 21700 | $188.98 |
| Poignée d’otoscope | Welch Allyn | 71000 | $112.20 |
| Spéculum réutilisable | Welch Allyn | 22002 | $3.98 |
| Pince | fine Miltex | 18-779 | $107.18 |
| Petit support de pince pour tenir l’otoscope | |||
| Vaporisateur d’isoflurane (circuit multiple avec traitement des gaz résiduaires sous vide) | Summit Medical3 | 000 $ | |
| Flexivent (ventilateur pour animaux) | SCIREQ35 | 000 $ | |
| Cathéter intraveineux (20 g, 1 po) | BD | 381233 | 9,62 $ |
| Tube en polyéthylène (PE10) (0,011 po de diamètre intérieur, 0,024 po de diamètre extérieur) 100 pi | Intramedic, Clay-Adams | 427401 | 115,70 $10,70 |
| Kétamine 100 mg/ml (10 flacon ml) | Butler | 23061 | $10.00 |
| Xylazine (flacon de 100 ml) | Vedco | 24105 | $20.00 |
| Isoflurane (flacon de 250 ml) | $15.00 | ||
| Bromure de vecuronium 10 mg/10 ml | Pfizer | NDC 0069-0094-01 | $15.00 |
Références
- Rockman, H. A., et al. Segregation of atrial-specific and inducible expression of an atrial natriuretic factor transgene in an in vivo murine model of cardiac hypertrophy. Proc. natl. Acad. Sci. U.S.A. 88, 8277-8281 (1991).
- Watanabe, A., Hashimoto, Y., Ochiai, E., Sato, A., Kamei, K. A simple method for confirming correct endotracheal intubation in mice. Lab. Anim. 43, 399-401 (2009).
- Orebaugh, S. L. Succinylcholine: adverse effects and alternatives in emergency medicine. Am. J. Emerg. Med. 17, 715-721 (1999).
- Hastings, R. H., Summers-Torres, D. Direct Laryngoscopy in Mice. Contemp. Lab. Anim. Sci. 38, 33-35 (1999).
- Berul, C. I., Aronovitz, M. J., Wang, P. J., Mendelsohn, M. E. In vivo cardiac electrophysiology studies in the mouse. Circulation. 94, 2641-2648 (1996).
- Ewart, S. L., Gavett, S. H., Margolick, J., Wills-Karp, M. Cyclosporin A attenuates genetic airway hyperresponsiveness in mice but not through inhibition of CD4+ or CD8+ T cells. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 14, 627-634 (1996).
- Ewart, S. L., Mitzner, W., DiSilvestre, D. A., Meyers, D. A., Levitt, R. C. Airway hyperresponsiveness to acetylcholine: segregation analysis and evidence for linkage to murine chromosome 6. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 14, 487-495 (1996).
- Spoelstra, E. N., et al. A novel and simple method for endotracheal intubation of mice. Lab. 41, 128-135 (2007).
- Boll, H., et al. High-speed single-breath-hold micro-computed tomography of thoracic and abdominal structures in mice using a simplified method for intubation. J. Comput. Assist. Tomogr. 34, 783-790 (2010).
- Brown, R. H., Walters, D. M., Greenberg, R. S., Mitzner, W. A method of endotracheal intubation and pulmonary functional assessment for repeated studies in mice. J. Appl. Physiol. 87, 2362-2365 (1999).
- Vergari, A., Polito, A., Musumeci, M., Palazzesi, S., Marano, G. Video-assisted orotracheal intubation in mice. Lab. Anim. 37, 204-206 (2003).
- Vergari, A., et al. A new method of orotracheal intubation in mice. Eur. Rev. Med. Pharmacol. Sci. 8, 103-106 (2004).
- Hamacher, J., et al. Microscopic wire guide-based orotracheal mouse intubation: description, evaluation and comparison with transillumination. Lab. Anim. 42, 222-230 (2008).
- Rivera, B., Miller, S., Brown, E., Price, R. A novel method for endotracheal intubation of mice and rats used in imaging studies. Cont. Top. Lab. Anim. Sci. 44, 52-55 (2005).
- MacDonald, K. D., Chang, H. Y., Mitzner, W. An improved simple method of mouse lung intubation. J. Appl. Physiol. 106, 984-987 (2009).
- De Vleeschauwer, S. pI., et al. Repeated invasive lung function measurements in intubated mice: an approach for longitudinal lung research. Lab. Anim. 45, 81-89 (2011).
- Zhao, X., et al. A technique for retrograde intubation in mice. Lab. Anim. 35, 39-42 (2006).
- Singer, T., et al. Left-sided mouse intubation: description and evaluation. Exp. Lung Res. 36, 25-30 (2010).
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Réimpressions et autorisations
