Article de méthode

Embryon de poulet moelle épinière culture Tranche Protocole

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DOI :

10.3791/50295

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25 mars 2013

 ,  , 
1Research Department of Cell and Developmental Biology, University College London

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Trancher les cultures de faciliter la manipulation du développement embryonnaire par le gène et les perturbations pharmacologiques. Toutefois, les conditions de culture doivent veiller à ce que le développement normal de procéder à l'intérieur de l'environnement réduit de la tranche. Nous illustrons un protocole qui facilite le développement normal de la moelle épinière se poursuivre pendant au moins 24 heures.

Résumé

Trancher les cultures peuvent faciliter la manipulation du développement de l'embryon à la fois pharmacologique et par des manipulations génétiques. Dans ce système réduit, les effets secondaires potentiellement mortels dus à des applications systémiques des médicaments peuvent être surmontés. Cependant, les conditions de culture doivent s'assurer que les produits normaux de développement au sein de l'environnement réduit de la tranche. Nous nous sommes concentrés sur le développement de la moelle épinière, en particulier celle des motoneurones spinaux. Nous varier systématiquement les conditions de culture des embryons de poulet tranches à partir du moment où les motoneurones spinaux plus était née. Nous avons mesuré le nombre et le type des neurones moteurs qui ont survécu pendant la période de la culture et de la position de ces neurones moteurs par rapport à celle in vivo. Nous avons constaté que le sérum et le type de facteurs neurotrophiques ont été tenus au cours de la période de culture et ont réussi à maintenir en vie les neurones moteurs pendant au moins 24 heures et permettre à ces neurones moteurs de migrer vers des positions appropriées dans lemoelle épinière. Nous présentons ces conditions de culture et la méthodologie de préparation des cultures tranche d'embryons utilisant des embryons de poulet éviscéré intégrés dans d'agarose et coupées en tranches à l'aide d'un vibratome.

Introduction

Au cours du développement normal de l'embryon, de nombreux types de cellules différents sont générés qui doivent migrer à partir de leur point d'origine à l'endroit où ils finiront par fonctionner dans l'organisme adulte. À l'intérieur de la moelle épinière en développement, les cellules progénitrices sont situés dans la zone du ventricule à la ligne médiane et générer plusieurs sous-types de neurones et de cellules gliales postmitotiques qui doivent migrer à intégrer dans les circuits neuronaux fonctionnels nécessaires au traitement sensoriel et moteur 1 sorties. Motoneurones spinaux qui contrôlent la contraction des muscles des membres ont été largement étudiés et bien connu des molécules et les mécanismes qui sous-tendent la formation de leurs différentes sous-classes. Cependant, on sait beaucoup moins sur les mécanismes par lesquels les neurones moteurs migrent, séparer et recevoir des entrées synaptiques.

L'identité du moteur sous-type de neurone est acquise lors du développement d'une manière hiérarchique. Sous-types de neurones moteurs peuvent être globalement classés icolonnes distinctes nto, les divisions et les piscines qui sont définis par leurs projections axonales. Moteur colonnes axones projet soit axiales, muscles viscéraux ou d'un membre. Divisions automobiles subdiviser le membre projetant des motoneurones de la colonne latérale du moteur (LMC) en saillie vers ceux muscles ventraux ou dorsaux 2. Au sein des divisions, des groupes de neurones moteurs appelé moteur piscines projet de muscles individuels dans la branche 2, 3. Motoneurones orthopédique saillie sont définis par l'expression du facteur de transcription FOXP1 4, 5, tandis que l'identité de division est caractérisée par l'expression des facteurs de transcription à homéodomaine Islet-1 (ventralement saillie) ou Lhx-1 (dorsalement en saillie) 6. En effet, Lhx-1 expression est nécessaire pour les projections appropriées dorsales des motoneurones 7. Chacun de ces sous-types distincts occupent des postes au sein de la moelle épinière; ventrales neurones moteurs en saillie viennent résider dedans dorsalement projecting neurones moteurs. Il en résulte la LMC étant séparés en soi-disant LMCmedial (LMCM) et LMClateral (PCIME) divisions. Organisation divisionnaire piscine et le moteur est acquis en deux phases 8. Dans la première phase, la ségrégation de la division est réalisée par une migration des neurones moteurs dans une caractéristique interne à la mode latéral. Les cellules PCIME sont générés après que les cellules LMCM etc PClME migre à travers le LMCM pour atteindre sa position de décantation finale. La deuxième phase se neurones moteurs dans une division et les clusters eux dans des pools de motoneurones, probablement par un tri dorso-ventral des neurones moteurs. Les membres de la famille caténine-dépendante cadhérine classique ont été montré pour être cruciale pour les deux phases de 8-10 moteur organisation des neurones. Cependant, la façon dont la fonction cadhérine contrôle le mouvement des cellules est mal comprise.

L'acquisition des identités colonnaire, de la division et de la piscine nécessite des signaux extrinsèques ce modèle intrinsèquementexpression c de 11 facteurs de transcription. En outre, environ 50% de l'ensemble des motoneurones meurent par apoptose au cours du développement normal dans un processus qui nécessite des signaux extrinsèques de la branche, en grande partie grâce à l'appui neurotrophique de survie des neurones moteurs. Ainsi, des neurones moteurs du développement nécessite un environnement approprié doit être maintenue à un timecourse relativement longue. Pour cette raison, les pratiques de production épinière cultures tranche cordon pour maintenir survie des neurones moteurs exigent l'élucidation des conditions de culture appropriées. Précédent cultures tranche des embryons ont été utilisés pour suivre le comportement de extrinsèquement ajouté purifiée populations neuronales 12-14. Cependant, à nos conditions de culture connaissances qui facilitent in situ survie des neurones moteurs et la migration dans la tranche elle-même n'ont pas été publiés. Nous avons modifié une condition de culture standard qui facilite la survie de purifier, dissociées des motoneurones crâniens afin de faciliter moteur neurone de développement au sein d'un système de culture d'embryons tranche. Nous avons aussi suivi le positionnement des motoneurones survivants et de démontrer que les positions normales grande partie de la division des neurones moteurs est acquis pendant la période de culture.

Protocole

1. Assurez-Solutions obligatoires

  1. 1 tampon phosphate M:. Peser 109,4 g Na 2 HPO 4 et 32 g de NaH 2 PO 4 H 2 0, mélanger et dissoudre dans de l'eau à un volume total de 1 litre.
  2. Phosphate Buffered Saline (PBS): Préparer un tampon phosphate 0,1 M, 0,15 M de NaCl. 100 ml de PBS devrait suffire pour le traitement de tranches de 10 embryons.
  3. Agarose: Heat solution de PBS à environ 70 ° C et ajouter solides de faible température de fusion d'agarose lentement tout en remuant continuellement. Rendre la solution à une concentration finale de 4% (p / v) d'agarose. Faire un bilan de 50 ml de cette solution. Laissez cette solution dans un bain d'eau maintenu à 48 ° C jusqu'à utilisation. Toute solution non utilisée d'agarose après l'expérience peut être conservé à 4 ° C pendant plusieurs semaines.
  4. Solution d'anticorps bloc: Ajouter sérum de veau foetal et le triton X-100 à une concentr finaleation de 1% (v / v) de sérum de veau foetal, 0,1% (v / v) de Triton X-100 dans du PBS. 10 ml de solution bloc suffira pour l'immunomarquage de 5 lames de coupes au cryostat.
  5. Fixateur: Préparer 0,75 mm NaOH, le paraformaldéhyde 4% (p / v) (ATTENTION). Pour préparer la quantité de chaleur nécessaire fixateur d'eau à 70 ° C, ajouter du NaOH concentré à la concentration finale souhaitée, ajouter du paraformaldéhyde solide et mélanger jusqu'à dissolution. Laisser refroidir sur glace à 4 ° C. 10 ml de cette solution sera suffisante pour 20 puits de tranches d'embryons.
  6. Solution de saccharose: Préparer 10 ml d'une solution de saccharose à 30% (p / v) contenant 0,1 M de tampon phosphate. 10 ml de cette solution sera suffisante pour 10 puits de tranches d'embryons.
  7. 70% (v / v) d'éthanol. Diluer 70 ml d'éthanol absolu avec 30 ml d'eau.
  8. Milieu de culture: Préparer une solution d'extrait d'embryon de poulet 1%, 1% de pénicilline / streptomycine, 0,35% de L-glutamine, 0,1% de 2-mercaptoethanol, poulet 4% de sérum, 2% B27 supplément et 100 ng / ml de facteur de croissance ciliaryneurotrophic (CNTF) tous dilués dans le milieu neurobasal, préparé sur la glace et a utilisé le même jour. 10 ml de milieu de culture est nécessaire pour des puits de 20 tranches d'embryons.

2. Préparation d'embryon de poussin

  1. Lieu oeufs fécondés de poules avec le côté le plus long horizontalement dans un incubateur projet forcée à 38 ° C jusqu'à ce qu'ils développent à l'étape 15 24. Ceci requiert environ 4 jours d'incubation.
  2. Le deuxième jour de l'incubation, la stérilisation de la coquille de l'oeuf en l'essuyant avec un mouchoir en papier imbibé d'éthanol à 70%. Soigneusement percer l'extrémité plate de la coquille d'oeuf à l'aide d'une aiguille de calibre 21 fixée à une seringue de 5 ml et 5 ml de retirer l'albumine. Cela réduit l'embryon loin du réservoir de manière l'embryon n'est pas endommagé lorsque l'enveloppe est ouverte. Remettez les oeufs dans l'incubateur et les incuber pendant 2 jours.
  3. Utilisation émoussée dumont N ° 5 forceps carefully percer le milieu, en haut de la coquille et de supprimer environ 9 cm 2 de coquille. Couper autour de l'embryon et soulevez délicatement sur l'embryon et le placer dans HBSS pendant la dissection. Les embryons doivent être mis en scène en fonction de Hamburger et Hamilton (1992) 15. Tous les embryons utilisés doivent être à proximité de stade 24. Les embryons qui montrent des signes d'anomalie doit être jeté.
  4. Enlever la membrane amnios, membrane chorio-allantoïde, la tête, et allantoïde l'aide de deux dumont ° 5 forceps. Eviscération l'embryon pour enlever tous les organes internes. Pour ce faire, couper la ligne médiane ventrale de l'embryon avec micro ciseaux de dissection, maintenez l'embryon dans la région rostrale du tronc avec une paire de pince, saisir la partie rostrale de l'intestin et le cœur et tirez caudale. Il est important que cela soit fait proprement. Vous devriez être capable de voir clairement l'embryon somites. Couper l'embryon en deux, transversalement entre la buds.Now membres supérieurs et inférieurs couper le corps thoraciquemur à l'aide des ciseaux de microdissection.

3. Préparation Slice embryon

  1. Retirer la solution d'agarose du bain-marie. Couper 5 cm du fond du jetable 3 ml plastique pipette Pasteur.
  2. Retirez délicatement la moitié lombaire de l'embryon disséquée par deux pinces au berceau de l'embryon de la solution de dissection et les placer dans un plat de Pétri sec. À l'aide de la pipette Pasteur, supprimer l'ordre de 2 ml d'agarose, une pipette de 0,5 ml environ au-dessus de l'embryon, puis aspirer la tranche embryon dans la pipette. Transfert de l'embryon et de l'agarose à une peau de moule en plastique de suite prendre soin de ne pas introduire de bulles dans l'agarose. Abaisser doucement l'embryon jusqu'au fond de l'agarose dans le moule en matière plastique avec la partie dorsale tournée vers le bas. L'embryon doit être positionné à droite à l'aide d'une aiguille de calibre 21. Les tranches contiendra également partie du membre en développement et il est important que l'orientation de l'embryon dans la géloseose se permettre cela. Placez le bateau sur la glace pour régler le agarose. Veillez à ce que l'embryon ne change pas d'orientation au cours de cette période (environ 2 minutes).
  3. Le Leica VT1000S vibratome (vitesse 3, Fréquence 4, 400 um d'épaisseur) devrait être mis en place avec la chambre de tranchage rempli avec du HBSS et entouré par de l'eau glacée. Le bloc d'agarose est ensuite collé à la plate-forme vibratome avec de la super glue. Le bloc d'agarose est garni d'une lame de rasoir pour laisser l'embryon pièce avec 1-3 mm d'agarose qui l'entoure. Les tranches qui comprennent des sections bourgeon de membre avec une claire apicale ectodermique Rigde sont sélectionnés et ces tranches sont ensuite placés dans HBSS. En général, il ya seulement un ou deux tranches appropriées par embryon. Retirez délicatement le agarose autour des tranches de tissu à l'aide de deux aiguilles. Il est essentiel que cela soit fait soigneusement et complètement.

4. Tranches d'embryons en culture

  1. Ajouter 500 ml de solution de culture (voir ci-dessus) à la requirnombre ed des puits d'une 24-puits traitées fixation ultra basse plaque de culture tissulaire. Transférer les tranches soin de la solution HBSS dans le puits. En général, nous essayons d'avoir deux à trois tranches dans chaque puits. Placer la plaque de 24 puits dans l'incubateur de culture tissulaire à 37 ° C avec 5% de CO 2 pendant 24 h.

5. Sectionnant les tranches d'immunocoloration

  1. Après la période de culture, ajouter 500 ul de solution tamponnée à chaque puits de tranches d'embryons et de laisser sur la glace pendant 20 min. La solution totale est ensuite retiré avec soin et trois lavages PBS sont réalisés, avec des intervalles de 5-min. Les tranches sont ensuite laissés dans une solution de saccharose à 4 ° C, jusqu'à ce que le puits de tranches, environ 6 heures, mais peut être laissé plus longtemps (par exemple la nuit).
  2. Retirez les tranches et tamponner une solution de saccharose supplémentaire et s'équilibrer dans environ 1 octobre ml pour environ 5 min à 20 ° C. Montez chaque tranche plat dans un moule OCT-remplie décoller en plastique.Après le montage, placer les moules verticalement sur de la glace sèche se solidifier.
  3. Monter les blocs octobre dans le cryostat et équilibrer les blocs à -24 ° C pendant environ 20 min. Couper chaque tranche de 15 mm montés sur les sections Superfrost-Plus diapositives. Les diapositives peuvent être conservés à -80 ° C jusqu'à leur utilisation.

6. Immunofluorescence

  1. Pipette 1-2 ml de PBS sur les glissières horizontales tenues dans une chambre humidifiée avec les lames soulevées par le bas de la chambre (on utilise 1 ou 2 pipettes en plastique fixés ml avec du ruban autoclave). Incuber les sections dans du PBS pendant 5 min à 20 ° C pour enlever l'excès octobre Retirer la solution de PBS à partir de la diapositive et ajouter 500 ml de solution de bloc sur les sections, incuber pendant 30 min à 20 ° C. Retirez le bloc de solution et ajouter immédiatement 500 ml de l'anticorps primaire dilué ajoutées aux diapositives, incuber à 4 ° C pendant 18-22 heures.
  2. Retirez solution d'anticorps primaire et a été immédiatementh les lames avec 1 ml de PBS pendant 5 min, trois fois à 20 ° C pour éliminer l'excès de solution d'anticorps primaire. Ajouter 500 ml d'anticorps secondaire dilué au cours des sections. Les lames sont ensuite laissé à 20 ° C pendant 30 min. La solution d'anticorps secondaire est ensuite retiré et la diapositive lavées 3 fois 5 minutes dans du PBS à 20 ° C.
  3. Après ces lavages, retirez la finale lavage PBS, tamponnez le bord de la lame pour enlever l'excès de PBS, ajouter deux gouttes de Vectashield sur les toboggans et poser délicatement une lamelle de verre sur les sections, en évitant la formation de bulles. Enlever l'excès de Vectashield blot à partir du bord avant des lames d'imagerie.

7. Imagerie

  1. L'image des sections immunocolorées. Nous utilisons un Nikon Eclipse E80i microscope à fluorescence équipé d'une caméra numérique Hamammatsu ORCA ER et 10 X, 20X et 40 X lentilles d'objectif.

Résultats

L'utilisation de tranches d'élevage afin de suivre le développement des neurones et des interneurones de projection a eu une influence sur notre compréhension progresse de la génération d'organisation au sein du cortex 16. Dans la moelle épinière, des neurones moteurs du développement a été suivi en utilisant des cultures de embryons de poisson zèbre au total 17. Toutefois, la colonne vertébrale du motoneurone organisation chez le poisson zèbre est relativement simple (en raison de l'absence des muscles des membres importants chez les poissons). Les mécanismes moléculaires qui sous-tendent une hiérarchie de la colonne vertébrale du motoneurone organisation au cours du développement des vertébrés supérieurs sont actuellement mal compris. Les conditions de culture qui favorisent la survie des neurones et la migration corps cellulaire dans les cultures tranche d'embryons de vertébrés supérieurs sont donc nécessaires. Actuellement, la colonne vertébrale cultures tranche moelle des vertébrés supérieurs ont été utilisés pour les neurones dissociés de semences sur le dessus de 12-14 tranches, d'enquêter sur les axones marqués par fluorescence dans la périphérie de la tranche18, ou du comportement de cellules souches dans le développement précoce du cordon médullaire 19. Trancher les conditions de culture pour les cordons médullaires plus tard, en particulier ceux qui maintiennent des neurones moteurs du développement font actuellement défaut.

Pour tenter de suivre la colonne vertébrale du développement neuronal, en particulier celui des neurones moteurs spinaux, nous avons étudié diverses conditions de culture qui pourraient favoriser la survie des neurones moteurs et l'acquisition de la commande initiale dans l'organisation du moteur grâce à la migration latérale des neurones. Les premiers essais utilisant l'étape 18 à l'étape 20 tranches de poulet embryonnaires de la moelle épinière révélées infructueuses, nous n'étions pas en mesure de garder en vie les neurones moteurs pendant plus de quelques heures et ont été incapables de démontrer la production d'un nombre important de cellules PCIME au cours de la période de culture (données non représenté). Nous avons donc étudié les cultures tranche de l'étape 24 embryons, un point de temps où la majorité des PClME et les neurones LMCM ont été générés, mais quand PClME neurone migration est encore à ses infancy (Figure 1a-c). Cette migration latérale des neurones PCIME est en grande partie achevée par étage 27, de 24 à 36 heures plus tard (Figure 1 ddl). Notre test pourrait donc être simplifiée pour être capable de garder les neurones en vie et pour faciliter leur migration latéralement dans la corne ventrale. Nous avons commencé nos expériences avec des conditions de culture relativement simples contenant une solution juste saline équilibrée de Hank avec ou sans sérum de poulet ou extrait d'embryon de poulet. Dans tous les cas, même si nous étions en mesure de maintenir les neurones LMC dans la tranche, nous avons trouvé peu de preuves de neurones PCIME est maintenue (au moins par l'expression de Lhx-1). En outre, nous avons trouvé l'expression inappropriée de gènes tels que HB9 dans la moelle épinière dorsale, une situation qui ne se produit in vivo (données non présentées). Ainsi, ces conditions de culture simples ne sont pas adaptés pour l'étude de l'acquisition des motoneurones organisation.

Nous avons donc cherché à conditio plus complexens et comme base utilisé une formulation qui a été publié afin de faciliter la survie des neurones embryonnaires de poulet dissociées moteurs crâniens. Cette condition 20 (1% d'extrait d'embryon de poulet, plume 1% Strep, 0,35% de L-glutamine, 0,1% de 2-mercaptoéthanol, sérum de cheval à 2%, 2% B27 supplément et 50 ng / ml de facteur de croissance ciliaryneurotrophic (CNTF) dans un milieu neurobasal (appelé ici Guthrie moyenne) ne garder neurones moteurs plus vivants que les médias les plus simples. De plus, il n'a pas donné lieu à l'expression fallacieuse de facteurs de transcription dans la moelle épinière dorsale. Cependant, la survie des neurones PCIME était pauvre (figure 1 gi, p). Nous avons donc varié ce que nous considérons être des facteurs clés dans le milieu de Guthrie, à savoir l'animal d'origine du sérum, la concentration du sérum et la concentration de CNTF dans le milieu. Nous avons trouvé que la modification du sérum de sérum de cheval poussin de sérum et une augmentation de la concentration de CNTF de 50 ng / ml à 100 ng / ml sensiblement augmenté til la survie des cellules PCIME et LMCM et a aussi permis leur migration dans la corne ventrale plus de 24 h des conditions de culture (figure 1 jl, p). Le nombre total de neurones moteurs, le rapport de LMCM de PCIME et, en effet, la migration des cellules PCIME dans la corne ventrale est apparu très similaires aux sections d'embryons qui avaient été autorisés à se développer dans ovo plutôt que dans la culture tranche (Figure 1 ko, p). Ainsi, nous croyons que, d'après l'expression du facteur de transcription nombre de cellules, et la position des neurones moteurs, nos conditions de culture normales tranche récapituler moteur spinal développement des neurones au moins sur une période de 24 heures.

figure-results-1
Figure 1. a - c. Statut de la génération de LMC (FOXP1 coloration dansb) et PClME (Lhx-1 dans une coloration) au stade 24. c est une opération de fusion des deux canaux. La ligne médiane est représentée par une ligne en pointillés et en D, V montre l'orientation de la dorso-ventrale (D, V) axe de la moelle épinière. D - f. . Statut de LMC (FOXP1 coloration en d) et PClME (Lhx-1 coloration en e) l'organisation au stade 27 f est une fusion des deux canaux g -. I. Lhx-1 (g) et FOXP1 (h) l'expression dans les sections d'une tranche cultivées dans un milieu qui favorise la survie crânienne de cellules neurones moteurs (moyen Guthrie, notre «milieu initial» voir référence 20). Lhx-1 n'est plus exprimée dans les neurones moteurs, bien qu'il y ait survie des cellules de LMC en évidence par FOXP1 expression. D, V (g) indique l'orientation de la dorsoventral (D, V) de l'axe de la moelle épinière. ML montre l'orientation de la médio-latérale (M, L) axe de la sj cordon Pinal - l. Cellules PCIME (Lhx-1 dans la corne ventrale en j) et la LMC en général (FOXP1 en k) peut être observée en tranches cultivées dans un milieu contenant 4% de poulet sérum et 100 ng / ml CNTF. Notez que certaines cellules PClME se trouvent dans une position latérale dans la corne ventrale. La flèche en (j) représente la position latérale d'une partie des cellules des PClME. (L) est une opération de fusion des deux canaux m -. O. Statut d'expression de Lhx-1 (m) et FOXP1 (n) dans des sections d'un embryon in ovo maintenu au cours de la culture de section de l'embryon représenté sur la j - l. (O) est une opération de fusion des deux canaux. P. La quantification du pourcentage de PCIME (FOXP1 + ve / Lhx1 + ve) contre les cellules LMC (FOXP1 + ve / Lhx1-ve) cellules présentes dans les cultures tranche dans des conditions différentes compared pour contrôler les embryons conservés in ovo (qui représentent 100%). Test t de Student *** représente p <0,01. Cliquez ici pour agrandir la figure .

Discussion

Le protocole décrit ici permet une tranche d'embryon de poulet pour être incubé pendant plus d'un jour, tout en gardant les motoneurones en vie et continue de migrer pendant la période de culture. En élucidant les conditions pour maintenir en vie les neurones moteurs, nous avons identifié plusieurs éléments clés nécessaires. Il semble que le sérum de poulet jusqu'à 4% est essentielle à la survie des neurones moteurs et son remplacement par du sérum provenant d'une espèce différente ne sont pas tolérés. Fait intéressant, nous avons constaté que la présence de fortes concentrations de sérum ont été préjudiciables aux tranches comme ils promus prolifération du tissu entraînant des distorsions flagrantes en forme de tranche. Plus important encore, la présence du facteur neurotrophique ciliaire se sont avérées essentielles. Il reste une possibilité distincte que les tranches peuvent être en mesure d'être cultivées pendant des périodes beaucoup plus que juste 24 heures, peut-être même permettant la visualisation des afférences sensorielles de la moelle épinière. En outre, la cultureconditions ture ici peuvent également se révéler utile pour trancher les cultures du tronc cérébral et le développement du cerveau moyen / cervelet.

Peut-être le plus grand bénéfice potentiel de l'utilisation de ces conditions de culture tranche est qu'ils facilitent la possibilité pour la manipulation pharmacologique de la fonction des protéines tout en minimisant le risque d'effets néfastes sur le reste de l'embryon, comme le cœur. Un grand nombre d'inhibiteurs et des agonistes de différentes voies de signalisation peuvent être utilisés pour évaluer la migration des neurones spinaux différents sous-types et, éventuellement, leur effet sur la formation de circuits locaux colonne vertébrale au cours du développement. En outre, certaines perturbations génétiques de l'expression des protéines, comme ceux qui font usage de siRNA et des oligonucléotides morpholino, souffrent du fait qu'ils ne peuvent être introduits au début du développement (en raison de limitations dans les procédures d'électroporation in ovo) et les effets ne durent que un court laps de tem pse (généralement une journée). Notre culture tranche est lancée à un stade ultérieur et offre la possibilité d'utiliser cette technologie tard dans le développement au stade de trancher pour voir leurs effets au cours de la période de la culture de la tranche.

Le protocole de culture tranche pourrait également permettre la visualisation de la colonne vertébrale à la fois neurone moteur ainsi que la migration des interneurones dorsale en temps réel via vidéo-microscopie time-lapse. Ceci pourrait être réalisé en utilisant la microscopie à contraste de phase sous une lumière blanche ou par l'utilisation de l'imagerie de fluorescence. Si cette dernière technique devait être utilisé, alors l'introduction de marqueurs fluorescents est nécessaire. Cela pourrait se faire soit par l'introduction de colorants fluorescents tels que Dil ou DiO soit via marquage rétrograde de la branche ou de marquage antérograde du ventricule ou de l'électroporation in ovo de constructions à conduire des protéines fluorescentes dans un sous-ensemble de neurones.

Déclarations de divulgation

Aucun des auteurs ont des intérêts ou conflits d'intérêts.

Remerciements

Nous tenons à remercier Boast Sharon pour des discussions éclairées et de nombreuses B. Novitch pour le don nature des anticorps à FOXP1. Ce travail financé par une bourse du Wellcome Trust à KCT et une subvention de projet par le Wellcome Trust au SRP (Grant numéro de référence 094399/B/10/Z).

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Œufs Henry Stewart Farms, Royaume-Uni Oeufs fécondés Brown Bovan Or poule (Henry Stewart Farms, Royaume-Uni), stockées à 14 ° C jusqu'à ce que l'incubation
Aiguille 21 Gauge BD-Microlance-3 304432
Seringue de 5 ml BD Plastipak 302187
N ° 5 Dumont pince Roboz RS 5045
Micro Ciseaux à dissection Roboz RS 5910SC (3,5 à droite)
Moules d'enrobage d'embryons: Peel Away moules Agar Scientific G3764 Forme pyramidale 22 mm à 12 mm
Super colle Power Flex, Loctite
L'éthanol SIGMA 32221
Di-sodium hydrogénophosphate, un mono-hydrate BDH 102454R
Sodium di-hydrogène phosphate mono VWR / BDH 102494C
Chlorure de sodium VWR / BDH 27810.295
Basse température de fusion d'agarose Invitrogen 16520
Sérum fœtal bovin Gibco 10500-064
Triton X-100 SIGMA T8787
Hydroxyde de sodium FLUKA 71689
Paraformaldéhyde VWR / BDH 28794.295
Plastique jetables pipettes Pasteur Elkay précision consommables de laboratoire 127-P503-000 Liquipette 3 Volume ml
Solution saline équilibrée de Hanks (HBSS) Gibco 14170
Saccharose SIGMA S0389
Carbonate acide de sodium SIGMA S5761
Extrait d'embryon de poulet Seralabs CE650-J
Pénicilline / Streptomycine solution Gibco 15070
L-Glutamine solution Gibco 25030
2-mercaptoéthanol Gibco 21985
Sérum de cheval Sud Labs Groupe 9028B
B27 supplément Invitrogen 17504-044
Milieu Neurobasal Gibco Cat ~ 2103
Facteur CilliaryNeurotrophic (CNTF) R et D Systems 557-NT-010
Poussin Sérum SIGMA C5405
Les anticorps primaires ont été achetés auprès de la Banque de développement d'hybridomes études, à l'exception des anticorps anti-FOXP1, qui étaient un cadeau aimable de Bennett Novitch de l'UCLA. Primaires dilutions d'anticorps étaient de lapin anti-FOXP1 (1/32000), Souris anti-Lhx1 / 2 (4F2) (1/50), la Guinée Pig anti-FOXP1 (1/1000).
Tous les anticorps ont été conservés à 4 ° C.
Anticorps secondaires Âne anti-Guinée Pig (cy3) (1:1000) achetés auprès de Jackson Laboratories Immunoreseach âne anti-souris Inc (Alexa Fluor 488) (1:1000), Donkey anti-lapin (Alexa Fluor 594) (1:1000) achetés chez Invitrogen
Tous les anticorps ont été conservés à 4 ° C.
Plaque de 24 puits Corning Costar 3473 attachement ultra plaque de 24 puits
Octobre Tissue Tek, Sakura 4583 Température de coupe optimale
Vectashield Vector Labs H1000 Vectashield fluorescente montage support
Diapositives Thermo Scientific Superfrost-Plus diapositives chargées positivement, 25 x 75 x 1,0 mm
Couvercle en verre VWR International 631-0167 25x60 mm
Tirage forcé incubateur: Lyon Electric Company maintenue humide en assurant des niveaux d'eau suffisants, toujours maintenu à 38 ° C
Cryostat Brite, Huntingdon, Royaume-Uni -36 ° C
Tissue Culture Incubateur DH Autoflow Nuaire 38 ° C CO, 5% 2
Vibratome Leica Leica VT1000-S
Microscope Nikon Nikon Eclipse E80i microscope à fluorescence
Appareil photo numérique Nikon Nikon DS5M et Hamammatsu ORCA ER

Références

  1. Jessell, T. M. Neuronal specification in the spinal cord: Inductive signals and transcriptional codes. Nature Reviews Genetics. 1 (1), 20-29 (2000).
  2. Landmesser, L. Distribution Of Motoneurons Supplying Chick Hind Limb Muscles. Journal of Physiology-London. 284, 371-389 (1978).
  3. Romanes, G. J. The motor pools of the spinal cord. Progress in Brain Research. 11, 93-119 (1964).
  4. Dasen, J. S., De Camilli, A., Wang, B., Tucker, P. W., Jessell, T. M. Hox repertoires for motor neuron diversity and connectivity gated by a single accessory factor, FoxP1. Cell. 134 (2), 304-316 (2008).
  5. Rousso, D. L., Gaber, Z. B., Wellik, D., Morrisey, E. E., Novitch, B. G. Coordinated actions of the forkhead protein Foxp1 and Hox proteins in the columnar organization of spinal motor neurons. Neuron. 59 (2), 226-240 (2008).
  6. Tsuchida, T., Ensini, M., et al. Topographic organization of embryonic motor-neurons defined by expression of limhomeobox genes. Cell. 79 (6), 957-970 (1994).
  7. Kania, A., Johnson, R. L., Jessell, T. M. Coordinate roles for LIM homeobox genes in directing the dorsoventral trajectory of motor axons in the vertebrate limb. Cell. 102 (2), 161-173 (2000).
  8. Price, S. R., Garcia, N. V. D., Ranscht, B., Jessell, T. M. Regulation of motor neuron pool sorting by differential expression of type II cadherins. Cell. 109 (2), 205-216 (2002).
  9. Demireva, E. Y., Shapiro, L. S., Jessell, T. M., Zampieri, N. Motor Neuron Position and Topographic Order Imposed by β- and γ-Catenin Activities. Cell. 147 (3), 641-652 (2011).
  10. Bello, S. M., Millo, H., Rajebhosale, M., Price, S. R. Catenin-Dependent Cadherin Function Drives Divisional Segregation of Spinal Motor Neurons. Journal of Neuroscience. 32 (2), 490-505 (2012).
  11. Haase, G., Dessaud, E., et al. GDNF acts through PEA3 to regulate cell body positioning and muscle innervation of specific motor neuron pools. Neuron. 35 (5), 893-905 (2002).
  12. Hotary, K. B., Landmesser, L. T., Tosney, K. W. Embryo slices. Methods in Cell Biology. 51 (51), 109-124 (1996).
  13. Hotary, K. B., Tosney, K. W. Cellular interactions that guide sensory and motor neurites identified in an embryo slice preparation. Developmental Biology. 176 (1), 22-35 (1996).
  14. Krull, C. E., Tosney, K. Embryo slices and strips: Guidance and adhesion assays in the avian embryo. Methods in Cell Biology: New Methods in Avian Embryology. Bronner-Fraser, M. 87, 2nd Edition, Elsevier Academic Press Inc. San Diego. 97-113 (2008).
  15. Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. (Reprinted From Journal Of Morphology, Vol. 88, 1951). Developmental Dynamics. 195 (4), 231-272 (1992).
  16. Rakic, P. A century of progress in corticoneurogenesis: From silver impregnation to genetic engineering. Cerebral Cortex. 16, I3-I17 (2006).
  17. Bingham, S. M., Sittaramane, V., Mapp, O., Patil, S., Prince, V. E., Chandrasekhar, A. Multiple mechanisms mediate motor neuron migration in the zebrafish hindbrain. Dev. Neurobiol. 70 (2), 87-99 (2010).
  18. Brachmann, I., Jakubick, V. C., Shaked, M., Unsicker, K., Tucker, K. L. A simple slice culture system for the imaging of nerve development in embryonic mouse. Developmental Dynamics. 236 (12), 3514-3523 (2007).
  19. Das, R. M., Wilcock, A. C., Swedlow, J. R., Storey, K. G. High-resolution Live Imaging of Cell Behavior in the Developing Neuroepithelium. J. Vis. Exp. (62), e3920(2012).
  20. Barnes, S. H., Price, S. R., Wentzel, C., Guthrie, S. C. Cadherin-7 and cadherin-6B differentially regulate the growth, branching and guidance of cranial motor axons. Development. 137 (5), 805-814 (2010).

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Culture de coupes d embryons de pouletneurones moteurs spinauxcoupe au vibratomemicroscopie par immunofluorescencedissection d embryonsinclusion en agaroseincubation en milieu de culturelavage au HBSSinclusion l OCTsectionnement au cryostat

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