Sélective traçage des fibres auditives dans le nerf vestibulo-cochléaire aviaire embryonnaire

Michelle R. Allen-Sharpley; Michelle Tjia; Karina S. Cramer

doi:10.3791/50305

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Article de méthode

Sélective traçage des fibres auditives dans le nerf vestibulo-cochléaire aviaire embryonnaire

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DOI :

10.3791/50305

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18 mars 2013

Michelle R. Allen-Sharpley¹ , Michelle Tjia¹ , Karina S. Cramer¹

¹Department of Neurobiology and Behavior, University of California, Irvine

Dans cet article

Résumé

Nous décrivons ici une technique de microdissection suivie par l'injection de colorant fluorescent dans le ganglion acoustique des embryons de poulet au début de traçage sélective des fibres axonales auditives dans le nerf et du cerveau postérieur.

Résumé

Le poussin embryonnaire est un modèle largement utilisé pour l'étude des périphériques et centraux projections des cellules ganglionnaires. Dans le système auditif, marquage sélectif des axones du nerf auditif dans VIIIe crânienne améliorerait l'étude du développement central circuit auditif. Cette approche est difficile en raison de multiples organes sensoriels de l'oreille interne contribuer à la VIIIe nerf ^1. De plus, des marqueurs qui distinguent de manière fiable contre les groupes auditif vestibulaires des axones dans le nerf VIII aviaire doivent encore être identifiés. Voies auditives et vestibulaires peuvent pas être distinguées fonctionnellement dans les embryons précoces, comme sensorielles-réponses évoquées ne sont pas présents avant que les circuits sont formés. Idéalement saillie axones VIIIe ont été tracées dans certaines études, mais auditives axone étiquetage a été accompagnée par l'étiquetage des autres composants nerveuses VIIIe ^2,3. Ici, nous décrivons une méthode de traçage antérograde du ganglion acoustique de façon sélective labeaxones auditives l sein du VIIIe nerf développement. Tout d'abord, après dissection partielle de la région céphalique antérieure d'un embryon de poulet 8-jour immergé dans le liquide céphalorachidien artificiel oxygéné, le canal cochléaire est identifié par des repères anatomiques. Ensuite, une micropipette de verre fine tiré est positionnée pour injecter une petite quantité de rhodamine dextrane aminé dans la région de canal adjacent et profonde, où les cellules ganglionnaires acoustiques sont situés. Dans les trente minutes qui suivent l'injection, les axones auditives sont tracées de manière centrale dans le cerveau postérieur et peuvent ensuite être visualisées après une préparation histologique. Cette méthode fournit un outil utile pour les études sur le développement de la formation auditive périphérique circuit central.

Protocole

1. Préparer les outils de dissection et réactifs suivants

Liquide céphalo-rachidien artificiel (ACSF, 130 mM NaCl, 3 mM de KCl, 1,2 mM KH ₂ PO _4, 20 mM NaHCO _{3, 3} mM HEPES, 10 mM de glucose, ₂ mM de CaCl2, 1,3 mM MgSO ₄₎ perfusion continue avec 95% _2/5% de CO ₂ à la température ambiante. Pour la perfusion, remplir au 2/3 de 500 ml à large ouverture Nalgene pot avec un trou percé dans le couvercle. Réservoir sera fixé par une tubulure à une tige de verre barboteur, qui pénètre dans la aCSF à travers le trou dans le couvercle du bocal. Régler la pression afin d'obtenir un flux constant de bulles qui atteignent environ 1/3 du liquide, mais ne sont pas suffisamment puissants pour provoquer des éclaboussures au-dessus de la jante. Submerger 5 ml flacons de verre (jusqu'à 6) dans le pot Nalgene pour séparer les échantillons individuels les uns des autres et de la turbulence de l'écoulement de gaz. ACSF doit être oxygéné pendant au moins 20 min avant l'une incubation de tissus.
Petit plat dissection de silicone (35 x 10 mmPetri mm revêtu en utilisant Sylgard Elastomere Kit) avec deux broches de dissection placés en polystyrène hexagonale petite (47 mm en bas) pèsent bateau.
Deux pinces à pointe fine, une pointe recourbée-pinces, un bécher de 50 ml, et un récipient pour les déchets de tissu.
Tiré de verre micropipette (1,2 OD / 0,9 ID) rompu à environ 20-50 um d'ouverture à l'extrémité et rempli avec de la rhodamine dextrane aminé (RDA, MW = 3.000, Invitrogen) dans une solution de 6,25% avec 0,4% de Triton X-100 dans du PBS . Fixer par un tube fin pour picospritzer et stabiliser à micromanipulateur.

2. Micro-dissection pour révéler Papille basilaire à ^4,5 E8

Avec des pinces courbes, couper E8 embryon juste en dessous du tronc cérébral, en plaçant directement sur la tête de dissection plat enduit de silicone à l'intérieur de peser bateau.
Utilisant des broches de dissection, positionner la tête avec une vue ventrale afin de l'oreille sur le côté de l'intérêt est légèrement visible, la tête légèrement inclinée sur le dos et pointant 10-30 degrés loin de CEnter (figure 2A). Immédiatement fixer la tête avec des épingles. Si bilatérale traçage est désiré, un centre de la tête à 0 degrés, ou une vue plein ventrale afin que les deux côtés peuvent être consultées. De même, pour une injection du côté gauche, fixer la tête de -10 à -30 degrés à partir du centre de sorte que le côté gauche est accessible.
En utilisant le bécher de 50 ml, 30 ml de transférer aCSF oxygéné dans le plat, entièrement immerger le tissu.
Saisissez doucement vers le bas et le zeste de la mâchoire inférieure en utilisant une pince fine pointe, puis retirez la paupière inférieure sur le côté de l'intérêt.
Retirez le tissu vasculaire sus-jacente, y compris tous les palais restant et l'œsophage. Ces tissus mous devrait décoller révélant la surface lisse de développer chondrocrâne avec les artères vertébrales distinctifs à sa surface. À ce stade, la caractéristique masse blanche otoconial doit être visible.
Disséquer soigneusement la peau autour du conduit auditif externe, le cartilage de l'articulation de la mâchoire et l'oreille moyenne, tout en laissant l'enner l'oreille intacte. Utilisez la pince pour couper délicatement ces structures cartilagineuses.
Retirer artères vertébrales et l'accumulation de sang à l'aide d'un léger mouvement de balayage avec les extrémités de la pince fine. Le sang peut obscurcir vue et la coagulation peut boucher l'ouverture pipette d'injection.
Le canal cochléaire avec épithélium sensoriel adjacente (papille basilaire) et le ganglion acoustique se trouve directement sous le chondrocrâne ⁶ et peut être visualisée comme une forme allongée en forme de doigt saillie s'étendant à partir de l'oreille interne ventralement, avec la pointe la plus distale (apex) près de la partie antérieure médiane ^5. Il peut y avoir une petite accumulation de sang (rouge) de la dissection et / ou des calcifications otolithiques (blanc) à l'apex de la cochlée conduit (figure 2B) qui peuvent aider à visualiser. Au sommet se trouve la macula lagenar, un patch sensorielle pensé pour être de la fonction vestibulaire ^7,8.

3. Étiquetage sélective des fibres NC VIII auditif

Placez la pipette d'injection près de la surface embryon à la région papille basilaire et conduit cochléaire.
Abaissez lentement la micropipette à première ponction du crâne. Cette région crânienne est plus mince que les zones environnantes et nécessite moins de force pour pénétrer. La micropipette devrait maintenant être à l'intérieur du canal cochléaire. En option: une petite injection de colorant de traçage peut être faite ici pour aider à la visualisation de la papille basilaire.
Sans avoir à repositionner la micropipette, continuer à baisser jusqu'à ce qu'il seulement à l'atteinte de la frontière profondeur du canal cochléaire (Figure 1). Effectuer une injection ici et répéter dans de multiples régions le long de la longueur de la papille basilaire (figures 2C, 2D), à l'exclusion de la pointe la plus proximale où le lagena vestibulaire est situé. Avec le picospritzer mis entre 10-30 psi, plusieurs injections sont faites. Le volume de fluide injecté de colorant varie, et dépend du degré de marquage souhaitée. Chaque injection doit se traduire par un colorant fluorescent-laBeled place d'environ 200 à 400 um de diamètre (figure 2D).
Une fois l'injection terminée, utilisez une pince pour sectionner l'échantillon au-dessus du tronc cérébral et d'utiliser une pipette de transfert pour placer la partie caudale dans un petit pot dans le conteneur de aCSF continuellement perfusés avec 95% O _2/5% de CO _2.
Pour chaque embryon, 20-30 min pour permettre le transfert de colorant, selon la distance du centre de traçage souhaitée.
Éliminer les tissus et préparer pour la coupe histologique. Dans l'exemple présenté ici, le tissu est immergé dans du paraformaldéhyde à 4% (dans du PBS 1X) pendant une nuit, le saccharose 30% (dans du PBS 1X) pendant une nuit.

4. La contre et analyse

La contre est utile pour aider à orienter l'observateur de la localisation anatomique ainsi que d'identifier les régions d'intérêt particulier. Une contre-coloration efficace dans cette préparation est immunomarquage neurofilaments (figures 1, 3b, 3e), où L vivementAbel axones et permet de délimitation des voies axonales dans le SNC.
L'analyse doit être effectuée dans toute la région étiqueté, comme les saillies peuvent s'étendre sur plusieurs centaines de microns ou plus long de l'axe rostro-caudal. Quelques exemples d'analyses de base sont les suivants: taux d'erreur de ciblage, le calendrier et / ou des changements dans la divergence des modèles de projections. Axones RDA-étiquetés sont visualisées dans le système nerveux périphérique et central à haute résolution (figures 3A, 3D).