Enregistrement de l&#39;activité électrique de neurones identifiés dans le cerveau intact des poissons transgéniques

Yali Zhao; Nancy L. Wayne

doi:10.3791/50312

Article de méthode

Enregistrement de l'activité électrique de neurones identifiés dans le cerveau intact des poissons transgéniques

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DOI :

10.3791/50312

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30 avril 2013

Yali Zhao¹ , Nancy L. Wayne¹

¹Department of Physiology, University of California, Los Angeles

Dans cet article

Résumé

Dans cette vidéo, nous allons démontrer comment enregistrer l'activité électrique de neurones isolés identifiés dans une préparation de tout le cerveau, ce qui préserve les circuits neuronaux complexes. Nous utilisons des poissons transgéniques dans lesquelles la gonadolibérine (GnRH neurones) sont génétiquement marquées avec une protéine fluorescente pour l'identification dans la préparation du cerveau intact.

Résumé

Comprendre la physiologie cellulaire des circuits neuronaux qui régissent les comportements complexes est grandement améliorée par l'utilisation de systèmes modèles dans lesquels ce travail peut être effectué dans une préparation de cerveau intact où les circuits neuronaux du système nerveux central reste intact. Nous utilisons des poissons transgéniques dans lesquelles la gonadolibérine (GnRH neurones) sont génétiquement marquées avec une protéine fluorescente verte pour l'identification dans le cerveau intact. Les poissons ont de multiples populations de neurones à GnRH, et leurs fonctions dépendent de leur emplacement dans le cerveau et le gène de la GnRH qu'ils expriment ^1. Nous avons concentré notre démonstration sur GnRH3 neurones situés dans les nerfs terminaux (TN) associés aux bulbes olfactifs en utilisant le cerveau intact de poisson transgénique médakas (figure 1B et C). Des études suggèrent que medaka neurones TN-GnRH3 sont neuromodulateur, agissant comme un émetteur d'informations provenant de l'environnement extérieur au système nerveux central; they ne jouent pas un rôle direct dans la régulation des fonctions hypophyso-gonadique, tout comme le bien connu hypothalamique GNRH1 neurones ^{2, 3.} Le modèle tonique de potentiel d'action spontanée des neurones TN-GnRH3 est une propriété intrinsèque ^4-6, la fréquence est modulée par des signaux visuels de leurs congénères ² et la kisspeptine neuropeptide 1 ^5. Dans cette vidéo, nous utilisons une ligne stable d'transgénique médakas dans lequel les neurones TN-GnRH3 expriment un transgène contenant la région promotrice du Gnrh3 lié à la protéine fluorescente verte ⁷ pour vous montrer comment identifier les neurones et surveiller leur activité électrique dans le cerveau entier préparation ^6.

Protocole

1. Dissection de cerveaux de l'adulte Medaka

Anesthésier adulte mâle ou femelle (figure 1A) par immersion dans 5 ml MS-222 (150 mg / L, pH 7,4); attendre quelques minutes après les mouvements de branchies ont cessé avant le décapiter. Toutes les procédures ont été approuvées par le soin des animaux et du Comité institutionnel de l'utilisation de l'Université de Californie-Los Angeles.
Décapiter le poisson dans une solution saline de poisson à l'extrémité caudale de l'opercule avec des ciseaux dans une boîte de Pétri diamètre 60 mm.
la tête de poisson de transfert à une boîte de Petri de diamètre 35 mm, à moitié rempli d'une solution saline poissons et bordée de Sylgard qui présente un renfoncement en elle pour positionner et fixer la tête pour la dissection des cerveaux. Positionner et fixer la tête dorso-latérale avec des épingles insectes.
Découpez soigneusement la partie dorsale du crâne autour de son périmètre avec des ciseaux fins et retirez-le délicatement avec une pince, exposant la partie dorsale du cerveau, y compris complètement la partie antérieure de la moelle épinière.
Soulever la moelle épinière délicatement avec une pince à pointe fine et couper les nerfs conjonctifs bilatéraux avec des ciseaux à pointe fine: les nerfs crâniens, les nerfs spinaux et des nerfs optiques sur la face ventrale du cerveau et les nerfs olfactifs à la partie antérieure de le cerveau.
Placez le cerveau entièrement disséqué dans un plat frais Petri remplie de sérum physiologique des poissons, et vérifiez soigneusement sous le microscope afin d'assurer la totalité du cerveau est intact (y compris la glande pituitaire), sans coupures ou perforations. Cerveaux endommagés ne sont pas utilisés pour l'expérimentation.

2. Montage du cerveau dans une chambre d'enregistrement

Placer une petite goutte de cyanoacrylate ou une autre colle à action rapide avec une aiguille dans le centre de la chambre d'enregistrement et étaler la colle d'environ 1 cm ^2.
Transférer rapidement le cerveau et le coller dans une position ventrale vers le haut.
Ajouter 1 ml d'une solution saline de poisson afin qu'il remplisse la chambre d'enregistrement et couvre le cerveau. Perfuser en continule cerveau avec une solution saline de poisson aérée à un débit d'au moins 200 pl / min.
Utilisation de la pointe fine Pince retirer soigneusement les méninges sur la surface de la zone d'enregistrement du cerveau.

3. Électrophysiologie

Lâche enregistrement de patch de potentiel d'action tir
1. microélectrodes de verre (6-10 MQ) sont construits à partir des pipettes en verre borosilicate (1B150F-4, World Precision Instruments) à l'aide d'un extracteur d'électrode (par exemple Sutter P-87), et le dos remplis avec la solution d'enregistrement libre-patch mi-chemin de l' électrode.
2. En utilisant un microscope à fluorescence verticale avec un dispositif à couplage de charge refroidi (CCD), trouver la GFP exprimant TN-GnRH3 neurones à travers 10x (figure 1B), puis des objectifs à immersion d'eau 40x (figure 1C). Ils sont situés à la surface ventrale des bulbes olfactifs, juste en avant du télencéphale ou à proximité.
3. Basculer vers un moniteur vidéo qui fournitimages en temps réel de la microscope pour localiser le neurone groupe TN-GnRH3 (figure 1C).
4. Positionner le micro-électrodes dans le bain de sorte que la pointe de l'électrode est au-dessus du neurone cible. Appliquer une légère pression constante positive à la micro-électrode de sorte qu'elle ne soit pas obstruée, et une approche en douceur le neurone cible avec la pointe de l'électrode.
5. Contrôler et surveiller la résistance de l'électrode en mode voltage-clamp en utilisant un logiciel de AxoGraph et amplificateur Axoclamp 200B avec le logiciel Axograph (Axon Instruments). Lorsque vous pouvez le voir sur le moniteur vidéo que la pointe de l'électrode est à la surface du neurone et de l'affichage de AxoGraph que la résistance change légèrement, relâchez la pression positive et appliquer une légère pression négative si nécessaire pour faire un joint à faible résistance sur le neurone (<100 MQ).
6. Passez en mode courant-clamp, et enregistrer la tension de la membrane en continu sans aucun courant d'entrée, le réglage de l'échellede la tension et la vitesse de l'enregistrement si nécessaire. Les données sont recueillies et analysées par le logiciel Powerlab (ADInstruments Inc.).
7. Fiche de référence activité électrique dans une solution saline de poisson normale pendant environ 5 min avant tout traitement (figure 2A). perfusion de bain de médicaments, hormones, peptides, etc. ajoutée à la solution saline de poissons se poursuit au rythme de 200 pi / min, suivie d'une période de sevrage chez les poissons solution saline normale ^{5, 6, 11.}
Enregistrement de cellules entières du potentiel de membrane
L'ensemble du patch clamp procédure d'électrophysiologie de la cellule est le même que celui de la procédure d'enregistrement mobiles extracellulaire correction décrite ci-dessus, à partir des étapes 3.1.1 - 3.1.4. Ensuite, les procédures diffèrent en conséquence:
1. Contrôler et surveiller la résistance de l'électrode en mode voltage-clamp. Lorsque vous pouvez le voir sur le moniteur vidéo que la pointe de l'électrode est à la surface du neurone et de l'oscilloscope que les changements de résistance légèrement, relâchez le positifpression et appliquer un peu de pression négative pour faire un joint haute résistance sur le neurone (~ 3 Giga Ω). Appliquer aspiration douce par la bouche à une rupture de la membrane patché, vous verrez une chute soudaine de la résistance à environ 120-250 MQ.
2. Passez en mode courant-clamp, et enregistrer la tension de la membrane en continu sans aucun courant d'entrée, en ajustant l'échelle de la tension et la fréquence de l'enregistrement si nécessaire.
3. Fiche de référence activité électrique dans une solution saline de poisson normale pendant environ 5 min avant tout traitement, tel que décrit ci-dessus en 3.1.7 (figure 2B).