TPS-Sa purification: A deux pas d'affinité Protocole Purification Cédant longs protéines purifiées

Résumé

Dans le présent protocole, nous démontrons une méthode de purification de protéine hautement efficace et rentable à petite échelle, qui permet la purification de protéines recombinantes en combinant de manière unique un TPS-marqueur clivable et une petite étiquette His.

Résumé

Dosages clés en enzymologie pour la caractérisation biochimique des protéines in vitro requièrent des concentrations élevées de la protéine purifiée d'intérêt. protocoles de purification de protéines devraient combiner l'efficacité, la simplicité et l'efficacité des coûts ^1. Ici, nous décrivons la TPS-Sa méthode comme un nouveau système de purification d'affinité à petite échelle de protéines recombinantes, basée sur une marque N-terminal glutathion Sepharose (TPS) ^2,3 et une étiquette de 10xHis C-terminal ^4, qui sont tous deux fusionné pour la protéine d'intérêt. Cette dernière construction est utilisée pour générer des baculovirus, par infection de cellules Sf9 infectées pour l'expression des protéines ^5. TPS est un peu long tag (29 kDa) qui sert à assurer l'efficacité de la purification. Toutefois, il pourrait influencer les propriétés physiologiques de la protéine. Par conséquent, il est par la suite éliminé par clivage de la protéine en utilisant l'enzyme PreScission ^6. Afin d'assurer une pureté maximale et d'éliminer la TPS clivé, nousd'ajouter une deuxième étape de purification par affinité sur la base de la relativement faible His-Tag. Surtout, notre technique est basée sur deux étiquettes différentes flanquant les deux extrémités de la protéine, qui est un outil efficace pour éliminer les protéines dégradées et, par conséquent, enrichit protéines pleine longueur. La méthode présentée ici ne nécessite pas une configuration instrumentale coûteux, comme FPLC. En outre, nous avons intégré _MgCl2 et lavages ATP pour enlever les impuretés chaleur de protéines de choc et de traitement à la nucléase de supprimer les acides nucléiques contaminants. En résumé, la combinaison de deux étiquettes différentes flanquant la N-et C-terminal et la capacité de cliver une des balises, garantit la récupération d'une protéine hautement purifiée et sur toute la longueur d'intérêt.

Introduction

La purification de protéines recombinantes est crucial de répondre aux questions fondamentales de la biochimie. Des moyens classiques de purification des protéines, comme la Chromatographie d'échange d'ions et une Chromatographie d'exclusion de taille dépendent des propriétés physiques de la protéine cible, tels que son point isoélectrique et la charge ou de la taille, respectivement. Ces dernières caractéristiques de protéine sont partagées par une variété de protéines, ce qui augmente considérablement le risque de contamination de protéines dans des stratégies de purification de protéines classiques. Ce problème peut être contourné par l'utilisation....

Protocole

Une. Production de baculovirus recombinant

Les baculovirus sont générés en utilisant le système d'expression Bac-to-Bac Baculovirus d'Invitrogen principalement en conformité avec le protocole du fabricant avec seulement de légères modifications:

1. Un vecteur pFastBac1 modifié (Gibco, la vie) a été créé contenant la TPS et ses balises (Figure 2). Le site clonage multiple (MCS) d'un animal-52b (+) vecteur (Novagen), contenant un 10xHis-étiquette, a été inséré dans le MCS d'un vecteur pFastBac1 pour générer pFastBac1-Strep-10xHis. La séquence de MCS pET-52b (+) a été amplifié par PCR entre les sites ....

Résultats

Afin d'illustrer l'efficacité de la GST-His protocole de purification, nous avons purifié Rec14, un S. protéine de 32,9 kDa pombe. Le Rec14 ADNc a été cloné dans notre vecteur pFastBac1 modifiée permettant l'ajout de la TPS et-ses-tags à la N-et C-terminales, respectivement (figure 1A). Baculovirus recombinants ont ensuite été préparés et utilisés pour infecter des cellules SF9 infectées pour l'expression de la protéine. Les lysats cellulaires solubles ont été incubées avec des billes .......

Discussion

Le-His TPS protocole de purification présentée ici est approprié pour la purification d'une large gamme de tailles et de protéines recombinantes: Nous avons purifié avec succès Li RAD51 (41kDa), piBRCA2 (120kDa), PALB2 (130kDa), et une protéine de haut poids moléculaire instable de Leishmania infantum: Li BRCA2 (125kDa) ^6,9. En outre, les protéines purifiées avec ce protocole étaient biochimiquement active ^6. Le succès de ce procédé dépend uniquement de l'expression, de la.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
REAGENTS
>E.Coli DH10Bac (competent)	Invitrogen
Bac-to-Bac Baculovirus Expression System	Invitrogen
Maxi Prep Kit	Qiagen	12163	Solution I et II
Ultra Pure Bluo-Gal	Gibco (Life)	15519028
IPTG	Gibco (Life)	15529019
Cellules infectées par Sf9	ATCC	CRL-1711
Enzyme de préscision	GE Healthcare	27084301
Milieu infecté de Grace complété	Gibco (Life)	11605-094
Sérum de bovin fœtal caractérisé	Hyclone	SH30396.03
P/S (Pénicilline-Streptomycine)	Gibco (Life)	15070-063
Glutathion Résine de sépharose	GE bioscience	17075605
Cocktail d’inhibiteurs de protéase	Roche	11873580001
Talon résine	Clontech	635504
Imidazole	BioShop	288324
Gentamicine	Gibco (Life)	15710064
Anticorps polyclonaux GST	Production en interne
Anticorps monoclonaux 6X-His	Clontech	631212
EQUIPMENT
Dounce homogénéisateur (étanche)	Wheaton	357546
Sonicator (Fisher dismembrator)	Fisher	Model 150
Sac de dialyse (50 mm)	Fisher Scientific