Article de méthode

La spécification des neurones glutamatergiques télencéphaliques de cellules souches pluripotentes humaines

DOI :

10.3791/50321

⸱

14 avril 2013

 ,  ,  , 
1Department of Neuroscience, The University of Connecticut Health Center, 2Department of Genetics and Developmental Biology, The University of Connecticut Health Center, 3Stem Cell Institute, The University of Connecticut Health Center

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cette procédure donne des neurones télencéphaliques en passant par les points de contrôle qui sont similaires à ceux observés au cours du développement humain. Les cellules peuvent se différencier spontanément, sont exposés à des facteurs qui les poussent vers la lignée neuronale, sont isolés et sont étalées sur des lamelles couvre-objet pour permettre une différenciation terminale et de maturation.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ici, une procédure par étapes pour générer efficacement télencéphaliques neurones glutamatergiques de cellules souches pluripotentes humaines (CSP) a été décrite. Le processus de différenciation est déclenchée par la rupture des CPP de l'homme en touffes qui complètent pour former des agrégats lorsque les cellules sont placées dans une culture en suspension. Les agrégats sont ensuite cultivées dans un milieu de CSEh jours 1-4 pour permettre une différenciation spontanée. Pendant ce temps, les cellules ont la capacité de devenir l'une des trois feuillets embryonnaires. De 5-8 jours, les cellules sont placées dans un milieu d'induction neurale pour les pousser dans la lignée neuronale. Autour jour 8, les cellules sont autorisés à fixer sur plaque de 6 puits et de se différencier au cours de laquelle la forme des cellules neuro-épithéliale. Ces cellules neuro-épithéliales peuvent être isolés au jour 17. Les cellules peuvent ensuite être conservé sous forme de neurosphères jusqu'à ce qu'ils soient prêts à être étalées sur des lamelles. L'utilisation d'un milieu de base sans aucun facteur de caudalizing, les cellules neuro-épithéliales sont précisésd télencéphaliques en précurseurs, qui peuvent ensuite être davantage différenciées en progéniteurs télencéphaliques dorsales et les neurones glutamatergiques efficacement. Dans l'ensemble, notre système offre un outil pour générer des neurones glutamatergiques de l'homme pour les chercheurs d'étudier le développement de ces neurones et les maladies qui les affectent.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les cellules souches pluripotentes (CSP), y compris les cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) et cellules souches pluripotentes induites (CISP), ont la capacité de produire tous les types de cellules dans le corps, y compris les neurones 1-3. Différenciation dirigée des différents sous-types neuronaux du PSC de l'homme détient la clé de l'application de ces cellules en médecine régénérative. La génération des sous-types neuronaux fonctionnels au cours du développement est un processus complexe impliquant l'induction de la lignée neuronale, la spécification des progéniteurs régionales le long de l'axe rostro-caudal, et la différenciation des types de neurones post-mitotiques des progéniteurs régionaux 4,5. A partir de 2001, plusieurs systèmes ont été mis en place pour générer des lignées de CSEh neurones, qui ont fourni une plate-forme pour la génération suivante de sous-types neuronaux 6,7. Basé sur les principes de développement, les types de neurones plusieurs comme la colonne vertébrale neurones moteurs 8-12, mésencéphale dopneurones aminergiques 13-15, les cellules rétiniennes neuronales 16,17 ont été efficacement spécifié dans les CSP de l'homme. Cela a été fait en appliquant morphogènes essentiels qui sont importants pour la spécification de ces types de neurones au cours du développement in vivo. D'autres protocoles ont également été élaborées pour promouvoir la différenciation des CSEh dans les neurones en utilisant soit des facteurs supplémentaires tels que les 18-20 petites molécules ou par co-culture avec d'autres types cellulaires pour aider à promouvoir la différenciation 21.

Le néocortex humain est très développé et contient de nombreux types cellulaires, y compris les neurones glutamatergiques qui jouent un rôle important dans l'apprentissage, la mémoire et la fonction cognitive 22,23. La première étape pour générer des neurones glutamatergiques dans la culture est de spécifier des cellules progénitrices télencéphaliques. Groupe de Yoshiki Sasai le premier signalé la différenciation dirigée des précurseurs télencéphaliques de la souris CES (mESCs) en utilisant une suspensio sans sérumn culture en présence de DKK1 (qui inhibe la signalisation Wnt) ainsi que LeftyA (qui inhibe la signalisation nodal) 24. Par la suite, plusieurs groupes, dont le nôtre ont également signalé la spécification des précurseurs télencéphaliques du PSC de l'homme dans le sérum 25-27 milieu exempt. La génération des précurseurs télencéphaliques du PSC de l'homme n'exige pas l'utilisation de morphogènes exogènes et l'efficacité dans la production de ces précurseurs est beaucoup plus élevé que celui de mESCs 26,27. Ici, un système chimique définie pour l'induction neurale qui a été bien établi par le groupe de Zhang 7 a été décrite. Sans l'ajout de facteurs exogènes caudalizing, ce protocole génère efficacement les précurseurs télencéphaliques du PSC de l'homme 27. Ces progéniteurs peuvent alors se différencier en progéniteurs dorsales ou ventrales en régulant la signalisation de Wnt et sonic hedgehog (SHH). Les progéniteurs dorsaux peuvent en outre se différencier en neurones glutamatergiques efficiently 27. En outre, ce protocole fonctionne aussi bien pour la génération de neurones glutamatergiques de l'homme iPSCs 28, qui permet de générer des neurones spécifiques du patient qui peuvent être utilisés pour explorer le mécanisme d'action ainsi que des thérapies potentielles pour un large éventail de maladies . De plus, notre système offre également une plate-forme pour explorer le développement et la spécification des divers types de neurones dans le télencéphale.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Protocole

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Génération des agrégats cellules souches pluripotentes humaines (D1 à D4)

  1. Cellules souches pluripotentes humaines sont mises en culture sur des fibroblastes embryonnaires de souris (MEF) alimentateurs en présence d'un milieu additionné de CSEh facteur de croissance des fibroblastes basique (bFGF, 4 ng / ml). Après 5-7 jours de culture, lorsque les colonies sont grandes, mais encore indifférencié, ils sont prêts pour la prochaine étape.
  2. La solution enzymatique doit d'abord être préparé. Dans un tube de 50 ml, dissoudre la dispase (ou collagénase) à un 1 mg / ml dans du milieu DMEM/F12 concentration. Comme ces solutions mélanger meilleur lorsqu'il est réchauffé, placez le tube contenant le milieu et de l'enzyme dans un bain à 37 ° C de l'eau pendant 10-15 minutes, puis le stériliser à l'aide d'un filtre Steriflip.
  3. Aspirer le milieu des cellules, les rincer à l'DMEM/F12, et aspirer ce lui aussi. Ajouter 1 ml de dispase à chaque puits et les placer dans l'incubateur pendant 3-5 min pour CSEh (jusqu'à 10 min pour iPSCs). Regardez les cellules au microscope, quandles bords se recourbent légèrement / regarder un peu plus sombre, les cellules sont prêtes pour l'étape suivante. Il est préférable de vérifier les cellules après 3 minutes et remettez-les en cas de besoin. Lorsque vous utilisez ce protocole pour la première fois, il est préférable de commencer avec une seule plaque de cellules à la fois, il est important d'éliminer les cellules de la dispase aussi rapidement que possible.
  4. Aspirer la dispase à partir des cellules. Doucement (les cellules sont très vulnérables à ce stade et se détache de la plaque relativement facilement) ajouter 1,5 ml de DMEM/F12 dans chaque puits afin de rincer le dispase. Aspirer le DMEM/F12 et ajoutez 1,5 ml de milieu de CSEh à chaque puits.
  5. Pour détacher et briser les cellules, placez la pointe d'une pipette en verre de 10 ml vers le coin en bas à droite d'un puits (toucher les cellules) et déplacez la pipette de haut en bas (verticalement) - l'attiser la hausse devrait se trouver à proximité à la course à la baisse procédure. Une fois de l'autre côté du puits est atteint, répéter à l'horizontale direction.
  6. Une fois que toutes les cellules sont en suspension, les placer dans des tubes de 15 ml et centrifuger les à 200 xg pendant 2 min. Il doit y avoir un culot de cellules au fond du tube. Aspirer hors du milieu au-dessus du culot.
  7. La taille du flacon de culture cellulaire qui devraient être utilisés pour maintenir les agrégats en fonction de la quantité initiale de cellules. Pour 6 puits plaque (1) de CSEh, un non-culture de tissus traités flacon T75 avec 50 ml de milieu de CSEh devraient être utilisés. Transférer les cellules de l'étape 1.6 à la fiole et incuber à 37 ° C.
  8. Afin de se débarrasser des débris cellulaires, le milieu cellulaire et le ballon doit être remplacé environ 12 heures plus tard. Pour ce faire, placer tous les moyens / cellules dans un tube de 50 ml, tourner les cellules vers le bas (200 g pendant 2 min), et aspirer hors l'ancien milieu. Ensuite, ajoutez 50 ml de milieu frais CSEh dans les cellules, et les placer dans un nouveau flacon T75. Les cellules peuvent ensuite être nourris quotidiennement suivant la même procédure (jusqu'à ce jour 5).

2. L'induction de cellules neuro-épithéliales (D5-D17)

  1. Transférer les cellules / moyen d'un tube de 50 ml et centrifuger les cellules pendant 2 min à 200 x g. Ensuite, aspirer le surnageant et transférer les cellules à une nouvelle (non-culture de tissus traités) flacon T75 avec 50 ml de milieu d'induction neurale (NIM).
  2. Une fois que les cellules sont en NIM, la moitié du milieu doit être remplacé tous les deux jours. Les agrégats doivent être suffisamment grande à l'endroit où ils se déposent au fond d'un tube de 50 ml conique sur eux-mêmes après quelques minutes (pas de centrifugation nécessaire). Après 2-3 jours de NIM (D7-D8 total), les cellules doivent être prêts à l'assiette. Laminine ou de sérum foetal bovin (FBS) peut être utilisé pour aider les cellules s'attachent aux plaques.
  3. Le nombre de cultures de tissus traités plaques à 6 puits qui sont nécessaires dépend de la densité des cellules dans chaque agrégat doit être capable de se développer sur la plaque pendant plusieurs jours sans toucher aucun des autres. En moyenne, les cellules d'unFlacon T75 donnera environ 4-6 6 plaques ainsi une valeur de cellules.
    1. Si vous utilisez la laminine, le diluer dans NIM à 10-20 g / ml pour enduire la plaque à 6 puits (~ 0,5 ml / puits). Après le revêtement pendant 2-3 h, agrégats cellulaires plaque sur des plaques 6 puits (~ 20-30 agrégats par puits). Après les agrégats ont été fixées, ajoutez 1,5 ml d'NIM.
    2. Si vous utilisez FBS, préparer un mélange de 90% de FBS NIM et 10% (1,5 ml / puits). Ajouter 1,5 ml de milieu avec les cellules à chaque puits, agiter doucement la plaque avant en arrière pour répartir les agrégats, et de permettre aux cellules de se fixer O / N dans un incubateur. Assurez-vous de changer le support (2 ml / puits de NIM) le lendemain matin pour enlever le FBS.
  5. Après un jour ou deux d'être plaqué, chaque agrégat sera étalée pour former une monocouche. En quelques jours, les centres de la plupart de ces cellules morphologiquement ressembler à des cellules cylindriques (forme allongée). Au cours de cette période, modifier le NIM tous les deux jours. Certaines lignes CFP (spécialement iPSC), peuvent former des cellules cylindriques de manière moins efficace. Dans ce cas, l'ajout de BMP et les inhibiteurs de TGF (Dorsomorphin 29, SB431542 19 à 2 pM) pendant la phase 2 peut être utile.
  6. Autour des jours 14-17, les cellules cylindriques apparaîtront plus compact. Parfois, ces cellules forment des crêtes ou des anneaux de lumière visibles à l'intérieur. Outre la morphologie colonnaire, les cellules à ce stade expriment des marqueurs neuro-épithéliales, comme PAX6 et SOX1 12,26.
  7. Avant l'isolement peut commencer, il faut d'abord examiner les cellules afin de déterminer s'il ya des cellules neuro-épithéliales non-présents. Un marqueur objectif peut être utilisé pour indiquer les colonies non-neuroépithéliales. Ceux-ci peuvent ensuite être éliminées en les grattant avec un embout de pipette.

3. Génération de progéniteurs télencéphaliques (D17-D24)

  1. Les centres des colonies contenant des cellules neuroépithéliales, et doivent être isolés du reste de la colonie. Cela peut être fait en utilisantune micropipette et un embout de pipette stérile de 1 ml filtré. Quand une petite quantité de pression est appliquée sur la partie centrale de la colonie, la soulève généralement hors assez facilement. Soyez prudent de ne pas laisser la partie extérieure de la colonie se détacher ainsi. Si les centres sont d'être têtu et ne se détache pas de leur propre chef, ils peuvent être enlevés en les retranchant l'aide d'une aiguille sous un microscope dans une hotte stérile. Transférez les parties centrales des colonies à un tube de 15 ml et centrifuger à 200 xg pendant 2 min.
  2. Le milieu doit être aspiré hors de la cellule. Deux plaques de dollars de cellules peuvent ensuite être transférées vers une culture de non-tissu traité T25 flacon contenant 10 ml de NIM avec l'ajout de B27 (sans vitamine A, 1:50). Utilisez 5-10 ml de milieu par une plaque de cellules.
  3. Lorsque les cellules sont vus le lendemain, ils devraient avoir une sphère comme l'aspect. Il est nécessaire de transférer ces cellules dans un nouveau flacon (en présence du NIM et B27, 1:50) que ce sont souvent les cellules périphériquesqui se faufiler à l'intérieur et attacher au fond du flacon.
  4. Le neurosphères devrait ensuite être cultivées en suspension pendant une semaine en utilisant NIM complété avec B27 (1:50). Dans le but de promouvoir l'endurance et la prolifération cellulaire, l'AMP cyclique (AMPc, 1 uM) et du facteur de croissance d'insuline (IGF-1, 10 ng / ml) peut être ajoutée dans le milieu au cours de la culture en suspension. À ce stade, les neurosphères contiennent des progéniteurs télencéphaliques (FOXG1 +) et sont prêts à être étalées sur des lamelles de différenciation terminale.

4. Différenciation plus loin dans les neurones télencéphaliques (D25 +)

    1. Préparer les lamelles recouvertes poly-ornithine/laminin (en plaques de 24 puits) pour l'étalement des cellules. Lamelles sont d'abord nettoyées et sont ensuite enrobés avec stratagème-ornithine (à 0,1 mg / ml, 37 ° C, O / N, et stocké au congélateur).
      Poly-ornithine revêtement:
      1. Stériliser les lamelles: Placez les lamelles dans unbécher contenant de l'acide nitrique et secouez doucement sous la hotte pendant une heure. Verser l'acide nitrique, rincer plusieurs fois avec de l'eau DI, et de laisser les lamelles sous l'eau courante DI pendant au moins 15 min. Placez les lamelles dans de l'éthanol à 95% et soit agiter pendant 30 min (si vous utilisez immédiatement) ou un magasin dans l'éthanol à température ambiante.
      2. Dans une hotte stérile, verser le contenu du tube de 50 ml contenant des lamelles stérilisés dans le couvercle d'une plaque à 6 puits. En utilisant des pinces stérilisées, ramasser une lamelle à la fois et placé debout dans un seul puits d'une plaque de 24 puits. Répétez sorte que chaque bien a une lamelle.
      3. Après avoir sécher complètement, appuyez sur les plaques jusqu'à ce que des lamelles sont tombés à plat dans chaque puits. Suivant ajouter 100 ul de poly-ornithine (0,1 mg / ml dans des conditions stériles dH 2 O) à chaque lamelle et incuber les plaques O / N à 37 ° C.
      4. Le lendemain, enlever les plaques de l'incubateur et les laisser refroidir à température ambiante. Aspirer poly-ornithine hors de chaque lamelle (à partir de l'arête de til lamelle) veillant à ne pas toucher ou rayer les lamelles dans le processus. Laisser sécher les lamelles pendant environ 30 min avant de les laver.
      5. Ajouter 1 ml stérile dH 2 O dans chaque puits et laisser reposer pendant 10 min, et aspirer hors de l'eau de chaque puits. Répétez cette étape de lavage à deux reprises. Après que les plaques sécher complètement, (congé couvre off dans la hotte) placer les couvercles sur, couvrir de papier d'aluminium, et conserver à -20 ° C.
      1. Pour enrober les lamelles avec la laminine, ajouter 50 ul d'un mélange de milieu de différenciation neuronale et la laminine (concentration finale de 20 pg / ml) à chaque lamelle de poly-ornithine traités en prenant soin d'avoir seulement le liquide de toucher la lamelle lui-même (et non pas renverser off). Les incuber à 37 ° C pendant 1-2 heures avant de préparer les cellules pour la fixation.
  2. Recueillir et centrifuger les neurosphères à 200 xg pendant 2 min dans un tube de 15 ml. Aspirer le surnageant.
    1. Rincer les cellules avec du DMEM-F12 et centrifuger les cellules à nouveau. Si les neurosphères sont trop grands pour fixer correctement, ils peuvent être dissociées avec Accutase à cette étape.
    2. Si vous utilisez Accutase: Après avoir lavé les cellules avec du DMEM-F12, les neurosphères sont dissociées de petites grappes en ajoutant Accutase (~ 2 ml) et incuber les cellules à 37 ° C pendant 3 min. Ensuite, ajoutez la même quantité d'inhibiteur de trypsine (~ 2 ml) et centrifuger les cellules à 200 xg pendant 3 min. Les cellules doivent ensuite être remis en suspension dans NDM et brisée à l'aide d'une pipette P200. Les petits groupes peuvent ensuite être étalées sur des lamelles de pré-enduits.
  4. Aspirer la majorité du support et placer les cellules sur un plat 6 cm de Petri dans quelques gouttes de telle sorte que le moyen de les sélectionner devient plus facile. Ajouter environ 4-5 neurosphères à chaque lamelle pré-enduit. Il n'est pas nécessaire d'aspirer au large de la laminine premier.
  5. Laissez le neurosphères joindre pendant au moins 2-4 heures. Une fois qu'ils ont unttached bien, plus moyen (0,5 ml / lamelle) devrait être ajouté. Il devrait être composé de milieu de différenciation neurale complété avec B27 (1:50), l'AMPc (1 uM), et les facteurs neurotrophiques (BDNF, le GDNF, et de l'IGF, le tout à 10 ng / ml). A ce stade, la moitié de la moyenne peut être changé tous les deux jours, et ces cellules peuvent être maintenues pendant plusieurs mois.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ici, un protocole de différencier les CSP de l'homme dans télencéphaliques neurones glutamatergiques au travers de plusieurs étapes essentielles: la formation d'agrégats de la CFP, l'induction de cellules neuro-épithéliales, la production de progéniteurs télencéphaliques et la différenciation terminale de ces progéniteurs en neurones télencéphaliques (Figure 1) a été décrits. Ce système est robuste et efficace dans la production de progéniteurs des neurones glutamatergiques et télencéphaliques. A titre ...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il ya plusieurs étapes importantes au cours du processus de différenciation neurale. Il est important de s'assurer que les CSP sont pluripotentes humaines car, sinon, les cellules peuvent déjà être biaisée en vue de devenir une lignée non neuronales. Cela peut être confirmé par coloration des CSP de l'homme avec des anticorps contre les marqueurs de pluripotence comme Oct4, Sox2, Nanog, et Tra-1-60 1-3. Si les guichets de l'homme n'attache pas très bien après les passages, inhibiteur de ROCK (...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs déclarent n'avoir aucun conflit d'intérêts financiers.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs tiennent à remercier le Dr Y. Sasai pour avoir généreusement fourni l'anticorps FOXG1. Ce travail a été soutenu par des subventions souches Connecticut recherche sur les cellules (08-SCB-UCHC- 022 et 11-SCB24) et la Fondation paraplégie spastique.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Milieu d’aigle modifié de Dulbecco avec mélange de nutriments F12 (DMEM/F12)Gibco11330-032
Substitut de sérum KnockoutGibco10828-028
L-glutamine (200 mM)Gibco25030
Acides aminés non essentielsGibco1140-050
2-Mercapt– ; thanol (14.3 M)SigmaM-7522
Milieu neurobasalGibco21103-049
N2Gibco17502-048
B27Gibco12587-010
HéparineSigmaH3149
Poly-L-ornithine hydrobromure (polyornithine)Sigma116K5103
Laminine (humain)SigmaL-6274
Laminine (souris)Invitrogen23017-015
FBSGemini100-106
Albumine sérique bovine (BSA)SigmaA-7906
DispaseGibco17105-041
CollagénaseInvitrogen17104-019
AccutaseInnovative Cell TechnologiesAT104
Inhibiteur de ROCKStemgent04-0012
SB431542Stemgent04-0010
DorsomorphineStemgent04-0024
Facteur de croissance des fibroblastes 2 (FGF2, bFGF)Invitrogen13256-029
Inhibiteur de trypsineGibco17075
0,1 % gélatineAnticorps MilliporeES-006-B
Foxg1Anticorps Dr. Y. Sasai
Hoxb4 (1:50)Études développementales Hybridoma BankI12
Pax6 anticorps (1:5000)Études développementales Hybridoma BankPAX6
Nkx2.1 anticorps (1:200)ChemiconMAB5460
Tbr1 anticorps (1:2000)ChemiconAnticorps AB9616
vGLUT1 (1:100)Systèmes synaptiques135302
facteur neurotrophique dérivé du cerveau (BDNF)PrepoTech Inc.450-02
Facteur neurotrophique dérivé de la glie (GDNF)PrepoTech Inc.450-10
Facteur de croissance de l’insuline 1 (IGF1)PrepoTech Inc.100-11
Cyclique AMP (cAMP)SigmaD-0260
Sonic hedgehog (SHH)R& D1845-SH
Tubes de 50 mlBecton Dickinson (BD)352098
Tubes de 15 ml352097
Plaques à 6 puitsBD353046
Plaques à 24 puitsFlacons 353047
T25 (non traités)Flacons 353009
T75 (non traités)Sacs353133
Couvre-objectifsChemiglass Life Sciences1760-012
6 cm Boîtes de PétriBD353004
9'' pipettes en verreFisher13-678-20D
Filtres Steriflip (0.22 &mu ; M)Filtres MilliporeSCGP00525
Stericup 1 000 ml (0,22 &mu ; M)MilliporeSCGPU10RE
(Observer A1)de dioxyde de carbone ZeissR2625
(Hera Cell 150)Thermo Electron Corporation
(Sterilgard III Advance)Centrifugeuse The Baker Company
(5702 R)Eppendorf
Microscope à contraste de phase Incubateur Capot de biosécurité

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Takahashi, K., Tanabe, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
  2. Thomson, J. A., Itskovitz-Eldor, J., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
  3. Yu, J., Vodyanik, M. A., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318, 1917-1920 (2007).
  4. Jessell, T. M. Neuronal specification in the spinal cord: inductive signals and transcriptional codes. Nat. Rev. Genet. 1, 20-29 (1038).
  5. Wilson, S. I., Edlund, T. Neural induction: toward a unifying mechanism. Nat. Neurosci. 4, 1161-1168 (2001).
  6. Reubinoff, B. E., Itsykson, P., et al. Neural progenitors from human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 19, 1134-1140 (2001).
  7. Zhang, S. C., Wernig, M., Duncan, I. D., Brustle, O., Thomson, J. A. In vitro differentiation of transplantable neural precursors from human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 19, 1129-1133 (2001).
  8. Hu, B. Y., Weick, J. P., et al. Neural differentiation of human induced pluripotent stem cells follows developmental principles but with variable potency. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 4335-4340 (2010).
  9. Singh Roy, N., Nakano, T., et al. Enhancer-specified GFP-based FACS purification of human spinal motor neurons from embryonic stem cells. Exp. Neurol. 196, 224-234 (2005).
  10. Lee, H., Shamy, G. A., et al. Directed differentiation and transplantation of human embryonic stem cell-derived motoneurons. Stem Cells. 25, 1931-1939 (2007).
  11. Boulting, G. L., Kiskinis, E., et al. A functionally characterized test set of human induced pluripotent stem cells. Nat. Biotechnol. 29, 279-286 (2011).
  12. Li, X. J., Du, Z. W., et al. Specification of motoneurons from human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 23, 215-221 (2005).
  13. Perrier, A. L., Tabar, V., et al. Derivation of midbrain dopamine neurons from human embryonic stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 12543-12548 (2004).
  14. Roy, N. S., Cleren, C., et al. Functional engraftment of human ES cell-derived dopaminergic neurons enriched by coculture with telomerase-immortalized midbrain astrocytes. Nat Med. 12, 1259-1268 (2006).
  15. Yan, Y., Yang, D., et al. Directed differentiation of dopaminergic neuronal subtypes from human embryonic stem cells. Stem Cells. 23, 781-790 (2005).
  16. Meyer, J. S., Shearer, R. L., et al. Modeling early retinal development with human embryonic and induced pluripotent stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 16698-16703 (2009).
  17. Osakada, F., Ikeda, H., et al. Toward the generation of rod and cone photoreceptors from mouse, monkey and human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 26, 215-224 (2008).
  18. Carpenter, M. K., Inokuma, M. S., et al. Enrichment of neurons and neural precursors from human embryonic stem cells. Exp. Neurol. 172, 383-397 (2001).
  19. Chambers, S. M., Fasano, C. A., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nat. Biotechnol. 27, 275-280 (2009).
  20. Chambers, S. M., Qi, Y., et al. Combined small-molecule inhibition accelerates developmental timing and converts human pluripotent stem cells into nociceptors. Nat. Biotechnol. 30, 715-720 (2012).
  21. Kawasaki, H., Mizuseki, K., et al. Induction of midbrain dopaminergic neurons from ES cells by stromal cell-derived inducing activity. Neuron. 28, 31-40 (2000).
  22. Rubenstein, J. L., Beachy, P. A. Patterning of the embryonic forebrain. Curr. Opin. Neurobiol. 8, 18-26 (1998).
  23. Hevner, R. F., Hodge, R. D., Daza, R. A., Englund, C. Transcription factors in glutamatergic neurogenesis: conserved programs in neocortex, cerebellum, and adult hippocampus. Neurosci. Res. 55, 223-233 (2006).
  24. Watanabe, K., Kamiya, D., et al. Directed differentiation of telencephalic precursors from embryonic stem cells. Nat. Neurosci. 8, 288-296 (2005).
  25. Watanabe, K., Ueno, M., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 25, 681-686 (2007).
  26. Pankratz, M. T., Li, X. J., et al. Directed neural differentiation of human embryonic stem cells via an obligated primitive anterior stage. Stem Cells. 25, 1511-1520 (2007).
  27. Li, X. J., Zhang, X., et al. Coordination of sonic hedgehog and Wnt signaling determines ventral and dorsal telencephalic neuron types from human embryonic stem cells. Development. 136, 4055-4063 (2009).
  28. Zeng, H., Guo, M., et al. Specification of region-specific neurons including forebrain glutamatergic neurons from human induced pluripotent stem cells. PLoS One. 5, e11853(2010).
  29. Kim, D. S., Lee, J. S., et al. Robust enhancement of neural differentiation from human ES and iPS cells regardless of their innate difference in differentiation propensity. Stem Cell Rev. 6, 270-281 (2010).
  30. Zhang, X., Huang, C. T., et al. Pax6 is a human neuroectoderm cell fate determinant. Cell Stem Cell. 7, 90-100 (2010).
  31. Stern, C. D. Initial patterning of the central nervous system: how many organizers. Nat. Rev. Neurosci. 2, 92-98 (2001).
  32. Ma, L., Hu, B., et al. Human embryonic stem cell-derived GABA neurons correct locomotion deficits in quinolinic acid-lesioned mice. Cell Stem Cell. 10, 455-464 (2012).
  33. Li, W., Wei, W., et al. Generation of rat and human induced pluripotent stem cells by combining genetic reprogramming and chemical inhibitors. Cell Stem Cell. 4, 16-19 (2009).
  34. Lowry, W. E., Richter, L., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells from dermal fibroblasts. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 2883-2888 (2008).
  35. Dimos, J. T., Rodolfa, K. T., et al. Induced pluripotent stem cells generated from patients with ALS can be differentiated into motor neurons. Science. 321, 1218-1221 (2008).
  36. Ebert, A. D., Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cells from a spinal muscular atrophy patient. Nature. 457, 277-280 (2009).
  37. Lee, G., Papapetrou, E. P., et al. Modelling pathogenesis and treatment of familial dysautonomia using patient-specific iPSCs. Nature. 461, 402-406 (2009).
  38. Park, I. H., Arora, N., et al. Disease-specific induced pluripotent stem cells. Cell. 134, 877-886 (2008).
  39. Chamberlain, S. J., Chen, P. F., et al. Induced pluripotent stem cell models of the genomic imprinting disorders Angelman and Prader-Willi syndromes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 17668-17673 (2010).
  40. Kiskinis, E., Eggan, K. Progress toward the clinical application of patient-specific pluripotent stem cells. J. Clin. Invest. 120, 51-59 (2010).
  41. Koch, P., Tamboli, I. Y., et al. Presenilin-1 L166P mutant human pluripotent stem cell-derived neurons exhibit partial loss of gamma-secretase activity in endogenous amyloid-beta generation. Am. J. Pathol. 180, 2404-2416 (2012).
  42. Walsh, R. M., Hochedlinger, K. Modeling Rett syndrome with stem cells. Cell. 143, 499-500 (2010).
  43. Egawa, N., Kitaoka, S., et al. Drug Screening for ALS Using Patient-Specific Induced Pluripotent Stem Cells. Sci. Transl. Med. 4, (2012).
  44. Kola, I., Landis, J. Can the pharmaceutical industry reduce attrition rates. Nature Reviews Drug Discovery. 3, 711-716 (2004).

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Réimpressions et autorisations

Demander l’autorisation de réutiliser le texte ou les figures de cet article JoVE

Demander une autorisation

Mots-clés

Milieu d induction neuraleCellules neuro pith lialesFormation de neurosph resDiff renciation des neurones glutamatergiquesExpression de FoxG1Marqueur TBR1Expression de VGLUT1Analyse par immunomarquage

Articles connexes