Formation de l'épithélium de la prostate humaine utilisant la recombinaison des tissus de rongeurs urogénital Mesenchyme des sinus et des cellules souches humaines

Résumé

Pour élucider les mécanismes moléculaires qui sous-tendent premiers cancer de la prostate initiation, roman et systèmes de modèles humains et des approches novatrices ont désespérément besoin. Le potentiel de pré-prostatique sinus urogénital mésenchyme (UGSM) pour inciter les populations de cellules souches pluripotentes pour former l'épithélium de la prostate humaine est un outil puissant dans la recherche expérimentale de la prostate.

Résumé

Progrès dans la recherche du cancer de la prostate est sévèrement limitée par la disponibilité des systèmes modèles d'origine humaine et hormones naïve, qui limitent notre capacité à comprendre les événements génétiques et moléculaires qui sous-tendent l'initiation de la maladie de la prostate. Vers le développement de meilleurs systèmes modèles pour l'étude de la prostate humaine carcinogenèse, nous et d'autres avons profité de l'unique potentiel inductif pro-prostatique embryonnaire rongeur prostate stroma, appelés sinus urogénital mésenchyme (UGSM). Quand recombiné avec certaines populations de cellules pluripotentes comme les cellules souches embryonnaires, UGSM induit la formation de la prostate humaine normale épithéliums d'une manière dépendante de la testostérone. Un tel système de modèle humain peut être utilisée pour étudier expérimentalement et tester la capacité des gènes de susceptibilité au cancer de la prostate candidats à un rythme accéléré par rapport aux études typiques transgéniques de rongeurs. Comme les cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) peuvent être génétiquement modifiés dans la culture usinvecteurs knock-down avant recombinaison des tissus expression génique inductible g ou siRNA, un tel modèle facilite tester les conséquences fonctionnelles des gènes ou des combinaisons de gènes, qui sont pensés pour favoriser ou empêcher la cancérogenèse.

La technique d'isolement de populations pures de cellules UGSM, cependant, est difficile et l'apprentissage nécessite souvent quelqu'un avec une expertise précédente pour enseigner personnellement. Par ailleurs, l'inoculation de mélanges de cellules sous la capsule rénale d'un hôte immunodéprimé peut être techniquement difficile. Ici, nous décrivons et illustrons bonne isolation de UGSM à partir d'embryons de rongeurs et rénale implantation de la capsule de mélanges de tissus pour former l'épithélium de la prostate humaine. Une telle approche, à son stade actuel, nécessite in vivo de xénogreffes de cellules souches embryonnaires, les applications futures pourraient inclure dans la formation de la glande vitro ou l'utilisation de populations de cellules souches pluripotentes induites (CISP).

Introduction

Il ya un énorme besoin de meilleurs systèmes de modèles humains de cancer de la prostate. En particulier, des systèmes modèles pertinents de l'homme, des tissus de la prostate non malignes normales qui peuvent être manipulées génétiquement pour discerner directement le rôle des gènes spécifiques dans le déclenchement du cancer de la prostate serait extrêmement instructif. L'avènement de l'ère de la génomique a identifié de nombreux gènes qui pourraient avoir un rôle dans la formation du cancer. Un manque de systèmes modèles expérimentaux humains, cependant, compromet gravement notre capacité à tester fonctionnellement et caractériser les gènes de susceptibilité au cancer de la prostate candidats. Un système modèle idéal serait de faciliter les analyses fonctionnelles rapides et plus rapide de gènes de susceptibilité au cancer en combinaison avec des systèmes modèles de rongeurs transgéniques appropriés. En outre, un tel système de modèle humain permettrait caractérisation moléculaire des mécanismes de signalisation de la carcinogenèse prostatique vers la découverte et la validation de nouvelles thérapies pourprévenir la formation de cancer de la prostate.

Les cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) sont capables de former des tissus prostatiques humains comme des xénogreffes. En 2006, Taylor, et al. Rapporté que les CSEh peuvent être amenés à former des épithéliums de la prostate in vivo lors d'une nouvelle combiné avec rongeur sinus urogénital mésenchyme (UGSM) dans un délai de 8-12 semaines. ¹ Ces études étaient fondées sur les travaux antérieurs de le laboratoire Cunha montrant que les rongeurs UGSM embryonnaire peut favoriser la différenciation de la prostate des cellules souches et des populations de cellules épithéliales embryonnaires in vivo. ^2,3 La prostate se développe à partir d'une anlagen embryonnaire appelé le sinus urogénital (UGS), et avant le jour embryonnaire 17 (E17 souris ; jour E18 chez le rat) l'UGS peuvent être enlevés et physiquement divisé en épithélium (UGSE) et le mésenchyme (UGSM) ⁴ Cette approche de recombinaison de tissu a considérablement amélioré notre compréhension du développement de la prostate et la carcinogenèse, en particulier.facteur de croissance des Ly et des voies de signalisation hormonales et les relations moléculaires entre la prostate stroma et de l'épithélium. ^5-8 Cette méthode implique la combinaison ex vivo de UGSM avec la tige ou les cellules épithéliales de même ou d'espèce distincte et ces recombinants cellulaires / tissu sont implantées et développées et xénogreffes au sein souris hôte. ^4,9 Après une période de croissance in vivo, l'implant contient la prostate structures glandulaires épithéliales intégrés dans le tissu stromal. En outre coloration peut être effectué afin de déterminer si ces structures sont vraiment de la prostate et d'origine humaine ^10,11.

Protocole

Cette étude a été réalisée en stricte conformité avec les recommandations du Guide pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire du National Institutes of Health. Le protocole a été approuvé par l'Université de Chicago Institutional Animal Care et le Comité d'utilisation (IACUC, numéros protocole 72066 et 72231). Tout chirurgie a été effectuée sous anesthésie, et tous les efforts ont été faits pour minimiser la souffrance. L'cellules souches embryonnaires humaines ligne WA01 (H1; NIH-enregistrement # 0043) a été acquis auprès WiCell (Madison, WI) et cultivées en utilisant le protocole d'alimentation indépendante en utilisant mTeSR1 médias (technologies des cellules souches, Vancouver, BC). Les cellules ES ont été utilisés dans les dix passages de décongélation.

1. Isolation du sinus urogénital de souris ou rat embryons

1. Euthanasier une souris timed-enceinte (jour 17.5) ou rat (18,5 jours) par inhalation de CO ₂ pendant 5 min. La mort a été confirmée par l'arrêt des signes vitaux chez le rat. Puis casser le cou humanité. Le rà se euthanasiés à ce point. Vaporiser l'éthanol à 70% pour stériliser la peau et les flancs abdominale. Coupez la peau de l'abdomen et les couches musculaires, puis couper l'utérus, séparez les embryons de rat du sac amniotique, et couper le cordon ombilical. Transférer les embryons dans un tube Falcon de 50 ml contenant une solution saline équilibrée de Hank glacée (HBSS) et garder sur la glace. Les foetus sont euthanasiés par décapitation avec des ciseaux chirurgicaux.
2. Placez l'embryon en 100 mm boîte de Petri. Bissecter l'embryon avec des ciseaux au niveau de l'ombilic (figure 1A). Retirer l'estomac et l'intestin grêle. Révéler les ovaires et les testicules de l'embryon femelle chez l'embryon mâle (figure 1B et 1C). (Les ovaires sont situés au niveau des pôles caudal des reins. Les testicules sont à peu près au niveau de la vessie). A ce stade de développement, UGSM isolé de deux embryons mâles et femelles sont capables d'induire une lignée épithéliale prostatique en présence de l'hôtela testostérone. ⁴ Après ce point de temps de développement, cependant, les bourgeons prostatiques commencent à se former dans le UGSM, et l'isolement de UGSM pur est très difficile. ⁴
3. Sous le microscope de dissection, couper la paroi abdominale dans la ligne médiane avec Vannas ciseaux pour exposer la vessie et la paroi postérieure de l'abdomen. Libérer le tractus génital supérieur de pièces jointes (dans les embryons mâles, couper l'uretère, Wolff conduit et conduit Müllerian; dans les embryons femelles, couper l'uretère et Müllerian conduit). Libérer la vessie du cordon ombilical. Couper os pubien et carrément séparée de la paroi antérieure du sinus urogénital avec Dumont pince fine de pointe. Enfin, séparer la paroi postérieure du sinus urogénital du rectum. Couper le sinus urogénital avec la vessie à l'extrémité inférieure (à partir de l'urètre) et stocker le sinus urogénital en bloc (avec la vessie) dans du HBSS froid glace.

2. La séparation de la Mesenchyme des sinus urogénital

1. Retirez la vessie du sinus urogénital sous le microscope de dissection (figure 1D).
2. Transférer le sinus urogénital dans un tube Falcon contenant 1% de trypsine en calcium ^{(Ca2 +)} et magnésium (Mg ^{2 +)} de HBSS libres. Placer le tube dans un réfrigérateur à 4 ° C pendant 75 min.
3. Retirez la trypsine et de neutraliser la trypsine avec 10% de sérum bovin foetal (FBS) en milieu DMEM/F12.
4. Taquiner soigneusement le manchon mésenchymateuses collant du tube épithélial avec une aiguille ou Dumont pince fine de pointe (maintenir le tube épithélial intact réduit les risques de contamination des cellules épithéliales du mésenchyme, ce qui peut entraîner des glandes de rongeurs formant avec votre cellule souche dérivée de l'homme épithélium glandulaire) (figure 1D). ¹²
5. Transfert UGSM dans un nouveau tube Falcon contenant du milieu DMEM/F12 + 10% de FBS + 1% pénicilline / streptomycine (Pen / Strep; 0,5 mg / ml) + 1% d'acides aminés non essentiels (NEAA) plus 1 nM R1881. Place le tube dans un incubateur à 37 ° C avec 5% de CO ₂ pendant la nuit.
6. Centrifuger le tissu à 200 xg et jeter le surnageant. Laver avec tampon phosphate salin (PBS) (ne pas perturber le culot tissulaire).
7. Ajouter 0,2% de collagénase (en DMEM/F12) pour remettre en suspension les tissus. Incuber à 37 ° C avec doux balancement pendant 1 heure.
8. Vigoureusement vortex du tissu digestion trois fois jusqu'à ce qu'il devienne mélange unique cellule homogène et ajouter du milieu DMEM/F12 + 10% de FBS + 1% P / S + 1% NEAA + 1 nM R1881 pour neutraliser la collagénase.
9. Centrifuger à 200 xg, puis lavez en re-suspension des cellules de UGSM dans HBSS, et répéter trois fois pour se laver entièrement le UGSM. Enfin suspendre cellules mésenchymateuses en DMEM/F12 et compter les cellules en utilisant un hématimètre ou dispositif de comptage cellulaire.
10. Dissocier les cellules hES culture protocole utilisant des liaisons de libre avec mTeSR1 médias (Stem Cell Technologies, Vancouver, BC) en utilisant une digestion Accutase (Millipore, Billerica, MA). Laver les cellules hESau cours de la phase logarithmique de la croissance de leur chaleureux DMEM/F12 médias, puis ajouter la solution chaude Accutase 1x, et incuber à 37 ° C pendant 15-20 min jusqu'à ce que les cellules individuelles sont uniformément dissociées de colonies. Ajouter une quantité égale de 1x défini trypsine inhibiteur (Invitrogen, Grand Island, NY) pour neutraliser l'Accutase et la pipette doucement de haut en bas pour mélanger et diviser amas de cellules. cellules de pipette dans un tube à centrifuger et centrifuger 3 min à 200 xg, et remettre en suspension le culot cellulaire dans DMEM/F12 médias. Tube à centrifuger 3 min à 200 xg encore et éliminer le surnageant, puis remettre en suspension dans HBSS froid ou DMEM/F12 au volume désiré.
11. Ajouter cellules hES avec un ratio 1:2,5 de hES / cellules mésenchymateuses. ³ Ce sera une composition cellulaire de 1E ⁵ cellules UGSM avec 4E ⁴ CSEh par 10 ml (injection d'un seul rat UGS généralement des rendements d'environ ⁶ cellules mésenchymateuses 2E). Centrifuger à 200 g pendant 5 min, puis jeter le surnageant. Re-suspendre avec 75% Matrigel (BD Biosciences,San José, en Californie, mélangé avec 25% HBSS froid pour une manipulation facile) et placer le tube dans la glace pour l'injection de la capsule sous-rénale.

3. La transplantation de tissu recombinant Sous la capsule rénale

1. Préparer une zone chirurgicale stérile.
2. Anesthésier la souris nude athymique mâle avec ip kétamine / xylazine, utiliser un mélange frais contenant un rapport de la kétamine 01:01:08: xylazine: saline. Le dosage sera de 100 mg / kg de kétamine et 2,5 mg / kg de xylazine. Les animaux qui ne répondent pas à un orteil-pincement doivent être entièrement sous pendant 20-30 min.
3. Préparer chirurgicalement la souris par le rasage du site opératoire (si vous n'utilisez pas une souris nude), le nettoyage avec trois lingettes alternance de 70% d'alcool suivie d'une solution de bétadine et en appliquant un champ opératoire.
4. Mettez œil salve d'humidité (Altalube pommade ophtalmique) aux yeux de la souris pour éviter le dessèchement pendant l'anesthésie.
5. Au cours de la chirurgie, la vitesse de respiration et la température centrale du corps de la souris sont surveillés. Les taux de respiration shoULD être stable et maintenu à l'intérieur de 40-90 respirations / min. la température du corps de base est contrôlé par l'observation de la couleur des muqueuses et de la plante des pieds roses.
6. Faire une incision cm de la peau longitudinal 1,0 longtemps sur le dos. Continuer à couper la paroi abdominale dans une incision longitudinale de 0,5 cm.
7. Appuyez doucement sur le rein de l'abdomen et de garder l'humidité de la surface du rein en utilisant des gouttes de solution saline stérile.
8. Doucement percer la capsule rénale en utilisant un vide de calibre 27 aiguille de seringue. Une ponction très faible est suffisante. Ce sera le lieu où vous insérez votre aiguille émoussée d'injecter votre mélange cellulaire.
9. Remplir une aiguille de seringue émoussée de calibre 28 avec 10 pl de votre mélange de cellules. Insérez délicatement le site de ponction et pénétrer dans le parenchyme rénal pour atteindre une zone en dessous de la capsule rénale. Injecter 10 ul du mélange cellulaire pour former un bolus sur le rein sous la capsule rénale. Retrait de l'aiguille.
10. Retour du rein à la abdocavité terminal. Fixez la couche musculaire du péritoine avec des sutures de nylon 4-0.
11. Fermez la peau soit avec suture ou des agrafes.
12. Nettoyer le sang de la peau en utilisant une solution saline stérile.

4. L'analgésie post-opératoire et suivi

1. Injecter l'animal avec la buprénorphine (0,1 mg / kg toutes les 12 heures) ou le kétoprofène (3-5 mg / kg dans une solution saline chaque 12 h) pour gérer la douleur post-opératoire, et 1 ml de 37 ° C IP saline pour garder l'animal au chaud et de prévenir la déshydratation.
2. Placez l'animal dans une cage propre et placez-le sur un coussin chauffant doux.
3. Envoyez les animaux dos à la salle des animaux une fois qu'ils reprennent conscience et se déplacent à l'intérieur de la cage.
4. Observez l'animal quotidiennement les signes inattendus de maladie et d'infection pour les trois jours suivants. Les souris sont surveillés par l'observation des activités dans des cages dont la nourriture accéder et d'eau 1 jour post-opératoire. Si les souris présentent moins d'activités, kétoprofène est intrapéritonéale annonceson ministère à nouveau une fois par jour.
5. Retirez les agrafes de la peau ou des sutures deux semaines post-chirurgie.
6. Tissus xénogreffes peuvent être récoltées dès 8 semaines après la chirurgie. Xénogreffes peuvent être imagées in vivo en utilisant des ultrasons pour petits animaux (figure 2A), et des tissus fixés peuvent être sectionnés et colorés pour diverses protéines par immunohistochimie (Figure 3).

Résultats

S'appuyant sur ​​le rapport passionnant par Taylor, et al., Notre laboratoire a élaboré un protocole greffe utilisant le H1 couramment utilisé (NIH, désignée WA01, génétiquement mâle) lignée de cellules souches embryonnaires humaines. ¹ Cette ligne a été rigoureusement testé pour le contrôle de la qualité et est caryotype normale ¹³ Lorsqu'elle est cultivée de manière appropriée, les cellules hES peuvent être maintenues, élargi, et cryoconservés dans un état ​​indifférencié et pluripotent ...

Discussion

recombinaison de tissus à l'aide UGSM est une technique extrêmement utile pour étudier l'évolution de la prostate et les événements moléculaires menant à l'initiation du cancer de la prostate. Le potentiel d'induction de UGSM a été utilisé pour de nombreuses applications dans la recherche de la prostate, il s'agit notamment de renforcer la tumeur prendre des lignes et des tumeurs des cellules de la prostate, l'étude des interactions stroma-épithéliales, et former des recombinants de la prostate i...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Hank' s Solution saline équilibrée (HBSS)	GIBCO	14170
DMEM/F12	GIBCO	11330
R1881	Sigma	965-93-5	Mélanger à 1 μg/ml dans de l’éthanol (1 000x stock)
NEAA	GIBCO	11140
Pen-Strep Solution	GIBCO	15070	100x stock
Matrigel	BD Biosciences	354230
KETASET (chlorhydrate de kétamine)	Fort Dodge Santé animale	NDC 0856-2013-01	100 mg/ml ; diluer 1:10 dans une solution saline stérile
AnaSed (xylazine)	VET-A-MIX, Inc.	NADA 139-236	20 mg/ml ; dilué 1:10 dans une solution saline stérile
Trypsine	BD Biosciences	215240
Collagénase	Sigma	C2014
Kétoprofène	Fort Dodge	NDC 0856-4396-01	100 mg/ml ; dilué 1:1 000 dans une solution saline stérile
Pommade pour les yeux Altaire	Pharmaceuticals, Inc.	NLC 56641-19850
Leica MZ16 F Stéréomicroscope	Leica		N’importe quelle bonne lunette de dissection peut être utilisée.
Ciseaux à ressort Vannas	Fine Science Tools	15001-08
Seringue	Hamilton	84855
Aiguille Hamilton, petite RN, calibre 28, 0,5 pouces, Point Style #3 (Blunt)	Hamilton	7803-02
Coussinets de préparation à l’éthanol	Fisher Scientific	06-669-62
Coussinets de gaze stériles	Fisher Scientific	22-415-469
Ethicon Vicryl Suture (4-0 FS-2)	MedVet International	J392H	Aiguille, suture soluble
Autoclip 9 mm Wound Clips	Becton Dickenson	427631
PVP Iodine Prep Pads	Fisher Scientific	06-669-98
Ciseaux de dissection avec extrémité émoussée	Fine Science Tools	14072-10
Pince à pointe fine Dumont	Fine Science Tools	11252-50
Porte-aiguille avec ciseaux	Fine Science Tools	12002-14