L'imagerie tridimensionnelle de nociceptifs fibres nerveuses intra-épidermiques dans des biopsies de peau humaine

Résumé

Afin d'étudier les changements de fibres nerveuses nociceptives (intraépidermiques IENFs) dans les neuropathies douloureuses (PN), nous avons développé des protocoles qui pourraient examiner directement les modifications morphologiques tridimensionnels observés dans IENFs nociceptifs. Analyse tridimensionnelle de IENFs a le potentiel d'évaluer les changements morphologiques des IENF en PN.

Résumé

Une biopsie de la peau est couramment utilisé pour quantifier la densité des fibres nerveuses intraépidermiques (IENFD) pour le diagnostic de neuropathie périphérique ^1,2. À l'heure actuelle, il est de pratique courante de collecter 3 biopsies cutanées mm de la jambe distale (DL) et la cuisse proximale (PT) pour l'évaluation des polyneuropathies dépendant de la longueur ^3. Toutefois, en raison de la nature multidirectionnelle de IENFs, il est difficile d'examiner chevauchement structures nerveuses à travers l'analyse de l'imagerie en deux dimensions (2D). Alternativement, l'imagerie en trois dimensions (3D) pourrait fournir une meilleure solution à ce dilemme.

Dans le présent rapport, nous présentons les méthodes d'application de l'imagerie 3D pour étudier neuropathie douloureuse (PN). Afin d'identifier IENFs, des échantillons de peau sont traités pour l'analyse d'immunofluorescence d'un produit de gène de la protéine 9.5 (PGP), un marqueur neuronal casserole. À l'heure actuelle, il est de pratique courante pour diagnostiquer petits neuropathies de fibres en utilisant IENFD dissuaderminées par PGP immunohistochimie en utilisant la microscopie en fond clair ^4. Dans la présente étude, nous avons appliqué double analyse d'immunofluorescence pour identifier IENFD totale, en utilisant PGP, et IENF nociceptive, grâce à l'utilisation d'anticorps qui reconnaissent la tropomyosine-récepteur-kinase A, le récepteur (Trk A) une forte affinité pour le facteur de croissance nerveuse ^5. Les avantages de IENF co-marquage avec PGP et Trk anticorps de prestations de l'étude des PN par coloration clairement fibres PGP-positives, nociceptifs. Ces signaux de fluorescence peuvent être quantifiés pour déterminer les changements IENFD et morphologiques nociceptifs de IENF associés à PN. Les images fluorescentes sont acquises par microscopie confocale et traitées pour l'analyse 3D. 3D-imagerie fournit des capacités de rotation pour analyser plus avant les modifications morphologiques associées à PN. Pris dans leur ensemble, fluorescent co-marquage, l'imagerie confocale et l'analyse 3D bénéficient clairement de l'étude des PN.

Introduction

À l'heure actuelle, il est de pratique courante pour les médecins de quantifier la densité des fibres nerveuses intra-épidermique (IENFD) à partir de biopsies de peau poinçon, qui peuvent être utilisés pour diagnostiquer les petits neuropathies de fibres ^{3, 6-8.} Les biopsies sont prises à partir de la jambe distale (DL), 10 cm au-dessus de la malléole externe, et la cuisse proximale (PT), 20 cm en dessous du épine iliaque antérieure ^9. Tous IENF sont marquées d'utiliser le produit de gène de la protéine 9.5 (PGP), un marqueur neuronal pan ^10-12. À l'heure actuelle, il est de pratique courante pour diagnostiquer petits neur....

Protocole

Partie A: immunohistochimie

Préparation de la plaque de 96 puits et la prévention de fond coloration biopsies de peau sont recueillies auprès de sujets humains et incubé pendant 12-24 heures dans la solution de fixation (paraformaldéhyde à 2% avec une solution de L-lysine 0,75 M (pH 7,4) et 0,05 mM periodate de sodium) à 4 ° C comme précédemment décrit ^8. Les échantillons sont ensuite cryoprotégés en phosphate salin (PBS) tamponné avec 20% de glycérol à 4 ° C pendant 1 semaine, ancrée dans les milieux de montage de la température de coupe optimale (OCT), puis découpé en 50 sections um d'épaisseur sur un cryostat. Le protocole ....

Résultats

Nous avons appliqué le protocole actuel pour étudier la morphologie des IENF dans PT et DL biopsies cutanées de patients atteints de PN. La peau, à partir de trois sujets, ont été recueillis à l'Université de l'Utah pour démontrer la pathomorphologie associé avec PN. Les sujets suivants: Cas 1: un homme de 51 ans avec une histoire de PN du diabète de type 2 (durée: 14 mois; score de douleur: 51); Cas 2: un homme de 56 ans avec une histoire de PN du diabète de type 2 (durée: 108 mois; score de douleur: 47) et Cas.......

Discussion

Mesure de IENFD a été largement utilisé pour déterminer le degré de neuropathies périphériques ^13,14. À l'heure actuelle, le protocole le plus couramment utilisé ne mesure que les densités de fibres nerveuses qui traversent la membrane basale de l'épiderme, elle ne tient pas compte de branchement axonal et / ou les modifications morphologiques des nerfs. En outre, l'analyse IENFD actuelle n'a pas été montré une corrélation IENFD avec la présence de la douleur chez PN ^15.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
10X PBS	Fisher Scientific	BP399-4	Pour constituer 1X PBS
Image-IT FX Signal	Invitrogen	I36933	Image-IT
Protein Gene Product 9.5 (Lapin polyclonal)	AbD Serotec	7863-0504	PGP
Tropomyosin Related-Kinase A (Chèvre polyclonale)	R& D Systems	AF1056	Trk A
Alexa Fluor 488 âne &alpha ;-lapin	Invitrogen	A21206	AF488 âne &alpha ;-chèvre
Alexa Fluor 647 âne &alpha ;-chèvre	Invitrogen	A21447	AF647 âne &alpha ;-chèvre
Albumine, à partir de sérum bovin	Sigma-Aldrich	A7906-100	BSA
Triton X- 100	Sigma-Aldrich	T9284	TX-100
Boucle non calibrée	LeLoop	MP	199025 inoculation Boucle
Plaque d’essai à 96 puits	Corning Incorporated	3603	Plaque à puits
Réactif anti-décoloration Prolong Gold avec DAPI	Invitrogen	P36931	DAPI
Verre 22x22 mm	Fisher Scientific	12-541-B	Lamelles
traitement Superfrost Plus Lames de microscope	Fisher Scientific	12-550-15	Lames de microscope
Olympus Fluoview Laser Scanning Microscope confocal	Olympus	FV500
Température de coupe optimale	Sakura	4583	OCT
Cryostat Leica	Leica	CM1850	Cryostat

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