Dans cet article, nous présentons une méthode pour analyser les microvaisseaux tumoraux in vivo en utilisant la fluorescence dynamique vidéomicroscopie de contraste amélioré. Deux paramètres quantitatifs ont été acquises: densité capillaire fonctionnelle réfléchissant la vascularisation de la tumeur, et les fuites d'index reflétant la perméabilité de la paroi endothéliale.
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Article de méthode
Dans l'imagerie in vivo de angiogenèse tumorale en utilisant la fluorescence confocale vidéomicroscopie
Dans cet article
Résumé
Résumé
Confocale fibrée imagerie de fluorescence in vivo avec un faisceau de fibre optique utilise le même principe que la microscopie confocale à fluorescence. Il peut exciter fluorescente in situ dans les éléments à travers les fibres optiques, et ensuite enregistrer une partie des photons émis, par l'intermédiaire des mêmes fibres optiques. La source de lumière est un laser qui émet la lumière d'excitation au moyen d'un élément à l'intérieur du faisceau de fibres et qui scrute au-dessus de l'échantillon, recrée un pixel d'image par pixel. Comme cette analyse est très rapide, en le combinant avec un logiciel spécialisé de traitement d'image, des images en temps réel avec une fréquence de 12 images / s peuvent être obtenues.
Nous avons développé une technique pour caractériser quantitativement la morphologie et de la fonction capillaire, en utilisant un dispositif de vidéo-microscopie confocale de fluorescence. La première étape dans notre expérience était d'enregistrer des 5 films à sec dans les quatre quadrants de la tumeur de visualiser le réseau capillaire. Tous les films ont été traitées en utilisant le logiciel (jemageCell, Mauna Kea Technologie, Paris France) qui effectue une segmentation automatique des navires autour d'un diamètre choisi (10 um dans notre cas). Ainsi, on peut quantifier la "densité capillaire fonctionnelle», qui est le rapport entre la superficie totale de la cuve et la surface totale de l'image. Ce paramètre a été un marqueur de substitution pour la densité microvasculaire, généralement mesurée à l'aide des outils de pathologie.
La deuxième étape a consisté à enregistrer les séquences vidéo de la tumeur de plus de 20 min pour quantifier les fuites de l'agent de contraste macromoléculaire à travers la paroi capillaire dans l'interstitium. En mesurant le rapport de l'intensité du signal dans l'interstitium plus que dans les récipients, un "indice de fuite" a été obtenue, agissant comme un marqueur de substitution de la perméabilité capillaire.
Introduction
L'angiogenèse est un processus complexe qui implique 1 la formation de nouveaux vaisseaux sanguins à partir de vaisseaux préexistants. Des changements pathologiques dans la microcirculation des tissus, composées d'artérioles, des capillaires et des veinules,, sont impliquées dans un grand nombre de maladies telles que le cancer, l'inflammation ou le diabète. Il est donc essentiel de développer des méthodes pour évaluer quantitativement la structure et la fonction des microvaisseaux. Imaging permet l'étude des micro-vaisseaux dans un non-invasive ou micro-manière, en temps réel et in vivo, ainsi que des mesures répétées dans le temps chez le même animal 2.
Actuellement, dynamique contraste amélioré (DCE) imagerie 3 est couramment utilisé pour évaluer la microcirculation des tissus. L'imagerie par contraste amélioré dynamique est une technique qui va suivre dans le temps la biodistribution d'un traceur injecté par voie intraveineuse. De cette acquisition, les paramètres quantitatifs peuvent être extraites reflétant la vascularisation des tissus. Imagerie DCEa été le plus souvent utilisé avec CT, IRM ou échographie. Cependant, ces techniques d'imagerie ne permettent pas la visualisation directe des microvaisseaux, depuis leur résolution, à l'exception de l'utilisation de dispositifs expérimentaux spécifiques, reste le plus souvent macroscopique.
Dans cet article, nous proposons d'étudier la vascularisation de la tumeur à l'échelle microscopique et in vivo en utilisant l'imagerie optique de renforcement du contraste dynamique, avec fibrée vidéomicroscopie confocale. Nous avons utilisé un agent de contraste macromoléculaire (FITC-dextran) qui reste exclusivement dans les récipients ou les fuites à travers la barrière endothéliale dans l'interstitium, en fonction de son poids moléculaire et les caractéristiques de l'endothélium du tissu étudié 4. Cela a permis l'étude de la structure à la fois des microvaisseaux, en délimitant correctement les navires, et la perméabilité capillaire, par des fuites et l'accumulation dans le tissu interstitiel.
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Protocole
Une. Préparation de l'agent de contraste
- Pour FITC-dextran 70 kDa, la dose injectée est de 500 mg / kg (10 mg de FITC-dextran dilué dans 0,1 ml de solution saline pour une souris pesant 20 g).
- L'agent ne doit pas être exposé trop longtemps à la lumière. Pour éviter le blanchiment, il est recommandé de couvrir le tube de papier d'aluminium.
2. Anesthésie
- Les souris ont été anesthésiés par une injection intrapéritonéale d'un mélange de 1:4 de xylazine (Rompun 2%, Bayer, Puteaux, France) et la kétamine (kétamine 500, Virbac, Carros, France), respectivement 66 mg / kg et 264 mg / kg pour une souris de 20 g.
3. Préparation de l'Organe d'intérêt
- Nous rasé la souris à l'endroit d'intérêt (par exemple, sur une tumeur sous-cutanée). Poils d'animaux est souvent auto-fluorescent lorsqu'il blanc. Lorsque noir, il absorbe la lumière.
- La peau en regard de l'organe à imager été incisée. Il est important d'attendre jusqu'à ce que le bleeding s'est arrêté avant d'injecter l'agent de contraste, sinon il risque de fuir dans le sang et contaminer l'image.
4. Acquisition
- L'agent de contraste a été injecté à travers une ou l'autre de la veine jugulaire ou la veine caudale. Il n'y a pas ou peu de bruit de fond dans l'organe observé en l'absence d'un agent de contraste fluorescent.
- La sonde a été placée en face de l'organe à imager. Dans notre étude, c'est la tumeur.
- Le laser a été allumé pour éclairer la tumeur et de vérifier la fluorescence dans les capillaires.
- La tumeur a été explorée en déplaçant manuellement la sonde selon un mouvement très lent pendant l'enregistrement de visualiser le réseau capillaire. Il est important de maintenir une main ferme, et cette technique nécessite un peu d'expérience. Dans notre étude, cette première étape a permis la quantification de la densité capillaire fonctionnelle.
- La deuxième étape a été l'acquisition dynamique au fil du temps. Pour cette étude, nous avons utilisé un 70 kDa FITC-dextran. Il n'y a pas de fuite interstitielle dans la plupart des organes normaux, mais il est dans les tumeurs. Pour acquérir des images de la même position dans le temps (comme dans notre cas), il est important de mettre en place un système pour maintenir la sonde sur la zone d'intérêt. Cela a été fait en utilisant un support à la main pour tenir la sonde, et en plaçant un morceau de gel d'ultrasons sur la pointe de la sonde. Avant l'enregistrement, le temps a été dépensé pour stabiliser la sonde placée en contact avec la tumeur. Une fois la position a été fixée, il n'y avait qu'un mouvement minime en raison de la respiration de la souris. Le laser a été allumé pour enregistrer trois images toutes les 30 secondes pendant 20 min pour détecter la présence d'une fuite capillaire. Il a été éteint entre chaque enregistrement de réduire agent de contraste blanchiment.
- Dans notre expérience, les souris ont été sacrifiées à la fin de la procédure pour l'analyse histologique des tumeurs.
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Résultats
En utilisant les données recueillies, nous pourrions analyser quantitativement différents paramètres reflétant la microcirculation.
Nous avons étudié in vivo le réseau vasculaire périphérique d'une tumeur du côlon implanté dans des souris Balb-C en utilisant un système de fluorescence de vidéo-microscopie confocale fibrée (Cellvizio, Maunakea technologie, Paris, France 2), après l'injection d'un agent de contraste fluorescent macromoléculaire isothiocyanate de...
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Discussion
L'étude de la microcirculation de la tumeur est devenue essentielle dans la compréhension de la physiopathologie de la croissance tumorale, la diffusion et la réponse au traitement 1. L'imagerie optique est l'une des techniques qui peuvent être utilisées pour observer les capillaires au moyen d'un agent de contraste fluorescent et de quantifier morphologique (densité capillaire fonctionnelle) et (fuites d'index) des paramètres fonctionnels.
L'imagerie par m...
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Déclarations de divulgation
Nous n'avons rien à communiquer.
Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Insuline serynge Myjector 1ml 29G | Terumo Europe | BS-05M2913 | |
| Fluorescéine isothiocyanate-dextran 70 kDa | Sigma-Aldrich | 01619HH | 100 mg/mL dilué dans une solution saline |
| Vidéo microscopie confocale fibrée | Cellvizio - MaunaKea Technologies | ||
| Kit d’étalonnage et de nettoyage pour LEICAFCM1000 | Leica Microsystems | LSU-488 | Magasin à 4 ° ; C |
| Probe ProFlexTM Z | MaunaKea Technologies | ||
| Logiciel de mosaïquage | MaunaKea Technologies | ||
| Logiciel de détection de navires | MaunaKea Technologies |
Références
- Folkman, J. Fundamental concepts of the angiogenic process. Curr Mol Med. 3 (7), 643-651 (2003).
- Laemmel, E., Genet, M., Le Goualher, G., Perchant, A., Le Gargasson, J. F., Vicaut, E. Fibered confocal fluorescence microscopy (Cell-viZio) facilitates extended imaging in the field of microcirculation. A comparison with intravital microscopy. J Vasc Res. 41 (5), 400-411 (2004).
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Réimpressions et autorisations
