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Article de méthode

L'échocardiographie fœtale et Pulsed-ondes ultrasons Doppler dans un modèle de lapin de la restriction de croissance intra-utérine

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DOI :

10.3791/50392

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29 juin 2013

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1Division Woman and Child, Department Women, University Hospitals Leuven, 2The Ritchie Centre, Monash Institute of Medical Research, Department of Obstetrics and Gynaecology, Monash University, Victoria, Australia, 3Department of Cardiovascular Sciences, Katholieke Universiteit Leuven, 4Fetal and Perinatal Medicine Research Group, Institut d'Investigacions Biomediques August Pi i Sunyer (IDIBAPS), 5Maternal-Fetal Medicine Department, ICGON, Hospital Clínic, Universitat de Barcelona, Centro de Investigación Biomédica en Red de Enfermedades Raras (CIBERER)

Dans cet article

Résumé

Nous décrivons l'examen de la fonction cardiaque foetale avec échocardiographie fœtale fonctionnelle et contemporain fœtoplacentaire échographie Doppler utilisant le VisualSonics VEVO 2100 microultrasound dans un modèle chirurgicalement induite de restriction de croissance intra-utérin chez le lapin.

Résumé

Croissance restriction (RCIU) résultats fœtale intra-utérine de la fonction cardiaque anormale qui est apparent avant la naissance en raison des progrès fœtoplacentaire échographie Doppler et l'échocardiographie fœtale. De plus en plus, ces modalités d'imagerie sont employées en clinique pour étudier la fonction cardiaque et d'évaluer le bien-être in utero, guidant ainsi calendrier des décisions de naissance. Ici, nous avons utilisé un modèle de lapin de RCIU qui permet l'analyse de la fonction cardiaque de façon cliniquement pertinente. Après anesthésie induite isoflurane, RCIU est créée chirurgicalement au gestationnel jour d'âge 25 en effectuant une laparotomie, exposant l'utérus bicorne et puis ligaturer 40-50% des navires utéroplacentaires fournissant chaque sac gestationnel dans une seule corne utérine. L'autre corne dans le bicorne utérus de lapin sert fœtus de contrôle interne. Puis, après sa récupération à gestationnel jour d'âge 30 (à terme), le même lapin subit un examen de la fonction cardiaque du fœtus. L'anesthésie est induite avec Ketamine et xylazine par voie intramusculaire, puis maintenus par une perfusion intraveineuse continue de kétamine et de xylazine pour minimiser les effets iatrogènes sur la fonction cardiaque du fœtus. Une laparotomie de répétition est effectuée pour exposer chaque sac gestationnel et un examen de microultrasound (VisualSonics VEVO 2100) de la fonction cardiaque foetale est effectuée. L'insuffisance placentaire est évident par un indice de pulsatilité élevé ou une fin flux diastolique absent ou inversé de l'artère ombilicale Doppler onde. Le canal veineux et l'artère cérébrale moyenne Doppler est ensuite examiné. Échocardiographie foetale est effectuée par le mode B d'enregistrement, le mode M et la vitesse d'écoulement des formes d'onde en vue latérale et apicale. Hors calculs déterminent les variables standard en mode M cardiaques, excursion systolique plan annulaire tricuspide et mitrale, speckle tracking et d'analyse de la souche, l'indice de performance myocardique modifié et le flux vasculaire vitesse formes d'onde d'intérêt. Ce petit modèle animal de RCIU offre donc un examen de dans utero la fonction cardiaque qui est compatible avec la pratique clinique actuelle et est donc utile dans un contexte de recherche translationnelle.

Introduction

Le fardeau des maladies cardiovasculaires qui résulte de la restriction de croissance intra-utérine du fœtus (RCIU) ne peuvent pas être surestimée. C'est la principale cause de la mortinaissance après anomalies congénitales. 1 RCIU se réfère à un fœtus qui ne parvient pas à atteindre son potentiel de croissance et est généralement un résultat de l'insuffisance placentaire. 2 Chez les survivants, les maladies cardiovasculaires maladie se manifeste à travers la durée de vie avec une dysfonction myocardique apparent durant l'enfance et l'hypertension 3,4 ultérieur 5, 6 diabète, l'obésité et le développement dans la vie adulte - tous les facteurs de risque cardiaque cumulative, de la naissance à la mort prématurée d'une maladie cardiaque ischémique 7.

Développer des modèles animaux pour caractériser la communication materno-fœtale qui établit RCIU et la réponse du fœtus à la suite de la disponibilité réduite du substrat est nécessaire si nous voulons à la fois mieux comprendre la physiopathologie de la voiture RCIU liéesinsuffisance DIAC et d'élaborer des stratégies cardio-protectrices pour améliorer la santé foetale et postnatale. À cet égard, de nombreux modèles différents à travers différentes espèces ont été décrites. 8 RCIU est généralement induite par la mère en vertu de la nutrition avec un régime faible en protéines chez les rongeurs, 9 ablation chirurgicale ou la ligature du flux sanguin utérin chez les rongeurs et les cochons d'Inde 10 ou occlusion de l' artère ombilicale chez les ovins. 11 Cependant, il est évident qu'aucun modèle entièrement récapitule le RCIU humaine. 12

Dans cette étude méthodologique actuel, nous avons utilisé une approche bien validée d'interruption vasculaire utéro-placentaire sélective dans un lapin 13-16 qui ne produit pas seulement des réponses cardiovasculaires observées chez le foetus par échographie cliniquement 14, mais permet également l'interrogation de la fonction cardiaque foetale roman échocardiographie utilisant la technologie de microultrasound de la VisualSonics VEVO 2100. Bien que l'échographie Doppler de fetoplbateaux acental demeure la pierre angulaire de la surveillance prénatale courant de RCIU fœtus 17, l'échocardiographie fonctionnelle est de plus en plus utilisé pour fournir de nouveaux aperçus sur la physiopathologie de la maladie et d'évaluer le bien-être fœtal. 18 Par conséquent, ici nous prenons ces avancées de la recherche clinique et de décrire un modèle animal qui ports non seulement cette imagerie sophistication, mais fournit également la plate-forme expérimentale pour étudier les voies mécanistiques et de nouvelles thérapies.

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Protocole

Le protocole expérimental suivant est approuvé par le Comité d'éthique animale, Katholieke Universiteit Leuven, Leuven, Belgique. Nous avons suivi la procédure décrite précédemment chirurgical 13, y compris certains changements méthodologiques, en particulier dans la procédure d'anesthésie.

1. Induire restriction de croissance intra-utérin (RCIU)

  1. Heure du lapines gravides (hybride Dendermonde et la Nouvelle-Zélande Blanc) sont logés dans des cages individuelles sur un calendrier de lumière 12/12 h avec accès à l'eau et le lapin norme ad libitum à partir de l'âge gestationnel (AG) 18 jours. À GA 25 jours (à terme est de 31 jours environ), les lapins sont transférés à la salle d'opération pour la création chirurgicale de RCIU. Avant la chirurgie, attribuer aléatoirement une «affaire» (RCIU) et "contrôle" corne utérine dans l'utérus bicorne de lapin en utilisant un logiciel de randomisation (GraphPad Software, USA) 19. Taille de l'échantillon doit être déterminé par des calculs de puissance par individu res chercheurs pour leur question d'intérêt.
  2. Procédure anesthésie.
    anesthésie par induction est obtenue par l'administration de kétamine 35 mg / kg (CEVA Santé Animale, Bruxelles, Belgique) et de xylazine 5 mg / kg (CEVA Santé Animale, Bruxelles, Belgique) par voie intramusculaire dans la patte arrière. L'anesthésie est ensuite maintenue avec un mélange inhalation de 1-4% d'isoflurane (Isoba Vet; Abbott Laboratories Ltd, Queenborough, Kent, Royaume-Uni) en O 2 à 2 L / min. Placez un oxymètre de pouls (Nellcor N-20, Covidien, Irlande) sur la deuxième et troisième orteil maternelle de surveiller en permanence le rythme cardiaque et artérielle en O 2 saturation.
  3. Intervention chirurgicale.
    1. Prémédication. Avant de commencer la chirurgie, administrer des antibiotiques prophylactiques pénicilline G, 300.000 UI (Kela Pharma, Hoogstraten, Belgique), de l'utérus tocolytic acétate de médroxyprogestérone à 0,9 mg / kg (Depo-Provera, Pharmacia Upjohn, Puurs, Belgique) et la buprénorphine analgésique 0,03 mg / kg (Temgesic; Schering-Plough) Sous-cutanée en une seule seringue 2,5 ml.
    2. préparation de lapin. Placez le lapin sur un coussin chauffant pour la durée de l'opération. Enlever les poils du champ chirurgical abdominal et appliquer un antiseptique de povidone-iode 7,5% (Betadine, Purdue, Connecticut, USA). Un protocole aseptique complet est ensuite utilisé.
    3. Laparotomie abdominale. Infiltrer le site d'incision avec un anesthésique local (2 ml de lidocaïne 1%, B Braun Medical, Belgique) sous-cutanée. Le site de l'incision doit être d'environ 5 cm de longueur dans la ligne médiane, dans le 2/3 inférieurs de l'abdomen. Une fois que la peau est ouvert, utiliser un mélange de dissection et émoussé pour exposer la gaine du muscle grand droit. Des précautions doivent être prises pour éviter les glandes mammaires maternels vasculaires situées de chaque côté de la ligne médiane à l'entrée (figure 1A). Saisir la gaine du droit et du péritoine, tente d'empêcher l'inclusion accidentelle de contenu abdominal, et entrez soigneusement à l'aide dissection (figure 1B).
    4. Extériorisation utérine. Surround le champ opératoire avec des rideaux de gaze trempé dans une solution saline chauffée. Saisissez délicatement et extérioriser deux côtés de l'utérus bicorne. Il faut prendre soin de ne pas placer soit le vagin ou à la fin de l'ovaire de chaque corne utérine sous tension, car cela peut entraîner des saignements indésirables, la douleur et la contractilité utérine. L'assistant irrigue en permanence l'utérus exposé avec une solution saline chauffée à empêcher les contractions utérines. Palper et enregistrer le nombre de foetus présents dans chaque corne. Par convention, le fœtus à la fin de l'ovaire est désigné le premier foetus. Une corne utérine est le cas corne et l'autre est le guignol. Identifier la corne de cas précédemment attribués au hasard pour l'induction de RCIU et ensuite remplacer le guignol dans l'abdomen (foetus de contrôle interne).
    5. Chirurgicalement induite RCIU. Identifier les vaisseaux utéroplacentaires pour chaque sac gestationnel dans la corne de cas désigné (figure 1C).Chirurgicalement ligaturer 40-50% de ces navires utilisant un polyglactine suture 5-0 (Ethicon Vicryl, Johnson et Johnson Medical, Etats-Unis) (figures 1D-1F). Dans la pratique, il ya souvent trois faisceaux vasculaires alimentant chaque sac gestationnel. Dans ce cas, le plus grand faisceau vasculaire est ligaturé. Une fois terminé, l'utérus est à nouveau irriguée avec une solution saline chauffée et soigneusement remis à l'abdomen.
    6. Fermeture abdominale. Fermer l'abdomen en deux couches à l'aide d'un fonctionnement continu 2-0 polyglactine suture (Ethicon Vicryl, Johnson et Johnson Medical, USA). Fermer la peau avec subcuticulaire 3-0 polyglactine suture (Ethicon Vicryl, Johnson et Johnson Medical, USA). Aérosol en aluminium sur la plaie pour empêcher le lapin de s'immiscer plus tard avec les sutures.
    7. Recovery. Cessez anesthésie et observer de près la reprise de la respiration. Le lapin est alors logé comme décrit ci-dessus avec accès à la nourriture et de l'eau ad libitum et observé quotidiennement.

2. Échocardiographie fœtale et Pulsed-ondes ultrasons Doppler

  1. Le même lapin est ensuite transféré à l'AG 30 jours pour échocardiographie et l'échographie. Le lapin est posé sur un coussin chauffant pour la durée de l'examen.
  2. Procédure anesthésie.
    1. anesthésie par induction est obtenue par l'administration de kétamine 35 mg / kg (CEVA Santé Animale, Bruxelles, Belgique) et de xylazine 5 mg / kg (CEVA Santé Animale, Bruxelles, Belgique) par voie intramusculaire. Une fois posée, un accès veineux en utilisant une jauge canule 24 (BD Insyte-W, Becton Dickinson thérapie par perfusion Systems, Utah, USA) inséré dans une veine auriculaire périphérique.
    2. Maintenir l'anesthésie avec une perfusion continue de kétamine et de xylazine: 2 ml de kétamine (100 mg / ml) et 1,5 ml de xylazine (20 mg / ml) à 46,5 ml de sérum physiologique, puis infusée via une pompe seringue à 40 ml / h. Fixer un three-way-tap et fixer une seringue d'anesthésie de sauvetage 5: 2 mlkétamine (100 mg / ml) et 1,5 ml de xylazine (20 mg / ml). Bolus de 0,5 ml sauvetage anesthésie sont rarement nécessaires. Administrer la buprénorphine analgésique 0,03 mg / kg (Temgesic; Schering-Plough) subcutaneouslyprior à la chirurgie. L'oxygène 2 l / min est appliqué par masque. Placez un oxymètre de pouls (Nellcor N-20, Covidien, Irlande) sur la deuxième et troisième orteil maternelle de surveiller en permanence le rythme cardiaque et artérielle en O 2 saturation.
  3. Laparotomie abdominale et extériorisation utérine. Reportez-vous à 1.3.3 et 1.3.4.
  4. Positionnement du fœtus pour échocardiographie et échographie.
    1. Placez le lapin dans une position latérale orientée vers le chercheur. Cela facilite plus facile la récupération d'un seul sac gestationnel pour examen et évite toute traction excessive sur les navires utéroplacentaires. Autant que possible, essayez d'extérioriser un seul sac gestationnel à la fois pour minimiser l'exposition. S'assurer que le sac gestationnel exposée est placée sur une gaze irriguée avecréchauffé saline. Pour garantir des résultats standardisés entre les différents groupes d'étude, en général seulement le foetus à l'ovaire et se termine vaginales de chaque corne utérine sont utilisés dans l'examen échographique.
    2. La fonction cardiaque foetale est très sensible à l'effet d'extériorisation utérine, le changement de température et de pression du transducteur à ultrasons sur les vaisseaux placentaires. Pour minimiser ces effets confondants environnementales et iatrogènes sur la fonction cardiaque, l'échographie doit commencer immédiatement après extériorisation du sac gestationnel et doit être systématique et efficace. Dans notre expérience, les changements dans la fonction cardiaque du fœtus se produisent rarement dans les 5 premières minutes d'exposition. Si bradycardie fœtale est rencontré, retirer la sonde d'échographie, repositionner le fœtus pour éviter de plier les bateaux foeto-placentaire, irriguer avec réchauffé saline ou retourner brièvement le sac gestationnel dans l'abdomen de la mère. Si bradycardie fœtale est persistant, l'examen de cette fetus doit être abandonné au profit de l'examen de la prochaine fœtus.
  5. Échocardiographie fœtale.
    1. Le Visualsonics VEVO 2100 (Toronto, Canada) plate-forme de microultrasound haute résolution avec un logiciel d'analyse cardiaque et la tension installée est nécessaire. A VisualSonics MS-250 transducteur (VisualSonics, Toronto, Canada) est utilisé pour l'acquisition de données. Ceci a une fréquence centrale de 21 MHz avec une largeur de bande de 13 à 24 MHz. Le foyer géométrique est de 15 mm, la largeur maximale de l'image est de 23 mm et la profondeur maximale de l'image est de 30 mm. L'empreinte est de 28 x 5,75 mm. Les données sont acquises conformément à l'American Society of directives d'échocardiographie et les normes de performance de l'échocardiographie fœtale. 20
    2. L'acquisition de données 1: Vue latérale au niveau de la chambre avec vue sur quatre latéral, enregistrer un mode B ciné boucle d'au moins cinq cycles cardiaques pour déterminer la souche, la vitesse de déformation, de la vitesse et de déplacement.. Ce sont analysées hors ligne en utilisant le VevoStrain(Visualsonics, Toronto, Canada) algorithme tel que décrit précédemment dans la revue en détail. 21 indices d'échocardiographie en mode M peut alors être obtenue à ce point de vue standard. Hors mesures de structure et de la fonction cardiaque peuvent ensuite être analysées: ventriculaire interne et le diamètre du septum en systole et diastole, le volume, le volume systolique, la fraction de raccourcissement, la fraction d'éjection et le débit cardiaque 21.
    3. L'acquisition de données 2:. Vue apicale Au niveau de la apicale quatre cavités vue, en mode B boucle cine peut être répétée pour VevoStrain analyses comme décrit ci-dessus. M-Mode échocardiographie est utilisée pour évaluer tricuspide (TAPSE) et excursion mitrale annulaire plane systolique (mapse) et déformation longitudinale et la vitesse de déformation. 22,23 Ce point de vue apicale permet également l'évaluation des flux valvulaire vitesse formes d'onde et l'indice de performance myocardique modifié comme précédemment décrit 24.
  6. Fœtoplacentaire impulsion agita Doppler ULTrasound.

La vitesse d'écoulement des formes d'onde (FVW) de l'artère ombilicale sont obtenus en localisant les vaisseaux ombilicaux en utilisant Doppler couleur, puis en plaçant la porte d'échantillonnage Doppler pulsé sur l'artère ombilicale sur une boucle libre de cordon ombilical. 25 L'artère cérébrale (MCA) FVW milieu est situé en plaçant la grille d'échantillonnage Doppler pulsé juste au-delà de l'origine de la MCA fois le cercle de Willis est situé par Doppler couleur 26. Le canal veineux (DV) FVW est obtenue en plaçant la grille d'échantillonnage Doppler pulsé à la partie proximale de la DV vu avec Doppler couleur où il provient de la veine ombilicale intrahépatique soit dans une vue sagittale ou transversale du fœtus. 26 L'indice de pulsatilité (IP) est calculé hors ligne en utilisant le logiciel d'analyse cardiovasculaire VisualSonics.

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Résultats

Une croissance asymétrique limité fœtus et le placenta de ligature vasculaire utéro-placentaire est comparé à un foetus de contrôle normal et le placenta dans la figure 1F. Croissance asymétrique est confirmé par une diminution du poids de naissance néonatale et une augmentation de la circonférence de la tête: rapport de la circonférence abdominale à des contrôles. Les résultats représentatifs des études Doppler foeto-placentaire sont présentés dans la figure 2. Un modèle normal à faibl...

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Discussion

Nous avons utilisé une approche précédemment validée de réduire chirurgicalement le flux sanguin utéro-placentaire chez le lapin pour produire RCIU 13-16 et d'examiner plus tard la fonction cardiaque foetale 14 pour décrire la technologie de microultrasound et l'analyse de la fonction cardiaque disponible sur le VisualSonics VEVO 2100. La capacité à se reproduire fœtoplacentaire Doppler changements de fœtus RCIU humains dans un petit modèle animal et pour permettre ensuite l'examen de l...

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Déclarations de divulgation

L'auteur, le Professeur Jan D'Hooge a conclu un accord de recherche avec VisualSonics. Les auteurs n'ont aucune divulgation.

Remerciements

Ce travail est soutenu par un Hamilton-Fairley NHMRC Fellowship (RH, AL), le Programme d'appui aux infrastructures opérationnelles de l'époque victorienne gouvernement (RH, EW) et la Curie Industria-Academia partenariat Marie et Pathways Subvention parrainée par la Commission européenne (ME, PD) . Les auteurs tiennent à remercier le Dr André Miyague, le Dr Francesca Russo, Mme Rosita Kinnart et M. Ivan Laermans pour leur expertise technique dans la production de cette vidéo.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
KétamineCeva Santé Animalehttp://www.ceva.com/en
XylazineCeva Santé Animalehttp://www.ceva.com/en
Depot ProveraPharmacia Upjohn
Pénicilline GKela Pharmahttp://www.kela.be
LidocaïneB Braun Medicalhttp://www.bbraun.com/
TemgesicSchering-Ploughhttp://www.merck-animal-health-usa.com/
IsoluraneIsoba Vet ; Abbott Laboratories Ltdhttp://www.abbottanimalhealth.com/index.html
EthiconJohnson and Johnsonhttp://www.ethiconproducts.co.uk/products/sutures
EthiconJohnson and Johnsonhttp://www.ethiconproducts.co.uk/products/sutures
EthiconJohnson and Johnsonhttp://www.ethiconproducts.co.uk/products/sutures
VEVO 2100VisualSonicsSN100-0032http://www.visualsonics.com/
Aquasonic GelParker Laboratories01 02http://www.parkerlabs.com/ultrasound_products.html
Nellcor N-20PA Oxymètre de poulsCovidienhttp://www.nellcor.com/prod/PRODUCT. ASPX ? S1=POX& S2=MON& id=282& V

Références

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