Article de méthode

Analyse immunohistochimique dans le système nerveux central et périphérique Rat ganglionnaire sections de tissu

DOI :

10.3791/50425

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14 novembre 2016

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1Department of Clinical Neuroscience, Neuroimmunology Unit, Center for Molecular Medicine, Karolinska Institutet, 2Department of Neuroimmunology, Center for Brain Research, Medical University of Vienna, 3Department of Medical Biochemistry and Biophysics, Vascular Biology Unit, Karolinska Institutet

Dans cet article

Résumé

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Nous présentons ici un protocole optimisé et détaillé pour la double immunocoloration dans des coupes de tissu du système nerveux central (SNC) et des ganglions lymphatiques périphériques (LN) de rat fixées au formol et intégrées en paraffine.

Résumé

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Immunohistochimie (IHC) permet une visualisation très spécifique, fiable et attrayante protéine. Des performances correctes et l'interprétation d'un étiquetage multicolore à base d'IHC est difficile, surtout lorsqu'il est utilisé pour évaluer les interrelations entre les protéines cibles dans le tissu avec une teneur élevée en matières grasses telles que le système nerveux central (SNC).

Notre protocole représente un perfectionnement de la technique d'immuno-marquage norme particulièrement ajustée pour la détection des deux protéines structurales et solubles dans le SNC de rat et de ganglions lymphatiques périphériques (LN) affecté par la neuro-inflammation. Néanmoins, avec ou sans autres modifications, notre protocole pourrait probablement être utilisé pour la détection d'autres cibles de protéines apparentées, même dans d'autres organes et des espèces que présenté ici.

Introduction

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Malgré l'utilisation de pointe à haut débit les analyses effectuées sur le méthylome, transcriptome ou même au niveau du protéome, immunomarquage reste l'étalon or pour la détection de protéines directement dans l'échantillon de tissu, culture cellulaire ou un frottis cellulaire. En révélant le motif de localisation / distribution, immunohistochimie (IHC) peut évaluer les rapports relatifs et interrelations topographiques des protéines cibles, et même indiquer leurs activités biologiques. Par conséquent, IHC est largement utilisé à des fins cliniques et de recherche, par exemple, pour le diagnostic, les évaluations de traitement, l' étude des....

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Protocole

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Déclaration éthique
Présente étude est réalisée conformément aux lignes directrices de l'Office national suédois pour les animaux de laboratoire et de la directive du Conseil Communauté européenne (86/609 / CEE) en vertu des permis éthiques N338 / 09, N15 / 10 et N65 / 10, qui ont été approuvés par le Comité du Nord de Stockholm animal éthique.

1. Préparation des tissus

  1. Perfusion et fixation
    1. Anesthetize l'animal avec de l'isoflurane pour effectuer la perfusion transcardial via ventricule gauche. Amorcer le rinçage du système vasculaire avec du tampon phosphate salin ....

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Résultats

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immunomarquages ​​doubles (co-Colorations) ont été réalisées dans fixés au formol, rat de paraffine sections CNS et LN. 3-5 um tranches de tissu d' épaisseur ont été découpées à l' aide d' un microtome de traîneau, monté ensuite sur des lames de verre adhésives pré-enduits et traités comme décrit précédemment 10,11,12. En bref, après déparaffinage, réhydratation des tissus et de la peroxydase endogène, l'inactivation, des sections ont été soumises au processus de récupération .......

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Discussion

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les procédures IHC standard nécessitent souvent des ajustements spécifiques pour obtenir un résultat optimal, ce qui implique généralement une grande expérience, mais aussi l'approche "essais et erreurs". De la préparation des tissus jusqu'à la visualisation cible, presque chaque étape du protocole peut être soumis à des modifications conçues individuellement afin d'améliorer le résultat final. Double protocole de coloration présenté ici illustre la protéine à base de IHC ciblant particulièrement a.......

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Remerciements

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Nous remercions Hans Lassmann et Jan Bauer pour leurs conseils et leur soutien. Nous remercions également Katalin Benedek pour l’excellente assistance technique et Caroline Westerlund pour l’évaluation critique et linguistique.

Cette étude a été financée par des subventions de Biogen Idec, de la Fondation Wenner-Gren, du Conseil suédois de la recherche, de l’Association suédoise des personnes atteintes de handicaps neurologiques, de la Fondation suédoise du cerveau, du 6e cadre de l’UE EURATools (LSHG-CT-2005-019015) et de Neuropromise (LSHM-CT-2005-018637). Les bailleurs de fonds n’ont joué aucun rôle dans la conception de l’étude, la coll....

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Réactif
Isoflurane (Isofluran) : 1-Chlor-2,2,2-trifluoréthyle (éther difluorméthylique) 2-Chlor-2-(difluorméthoxy)-1,1,1-trifluoréthan (C3H2ClF5O)Baxter1001936060Irradiation oculaire. Influence probablement la fertilité et endommage le bébé dans l’utérus. Administrer uniquement dans un environnement anesthésiant correctement équipé.
Chlorure de sodium (NaCl)Merck1.0604
Phosphate Tampon Saline (PBS), compriméSigma-AldrichP4417
Paraformaldéhyde (OH(CH2O)nH (n = 8 - 100)), 4 % dans 1x PBSApl pharma34 24 28Danger pour la santé. Corrosif. Inflammable. Toxicité aiguë.
Éthanol ≥ ; 99,5 %, absolu (CH3CH2OH)Sigma-Aldrich459844-1LInflammable.
Xylène (Xylènes, grade histologique ; C6H4(CH3)2 Sigma-Aldrich534056Flamable. Toxicité aiguë.
Histo-Comp Paraffine WaxTissue-TekV0-5-1001
Lames de microscope adhésivesStarfrostMIC-1040-W
Substitut de xylol XEM-200 Vogel GmbHND-HS-200Sensibilisation respiratoire. Cancérogénicité.
Souris &alpha ;-CD8 (Ox-8) anti-rat, anticorps primaireAbD SerotecMCA48G
&alpha ;-Iba1 (AIF1) souris anti-rat, anticorps primaireMilliporeMABN92
&alpha ;-CD68 (ED1) souris anti-rat, anticorps primaireAbD SerotecMCA341R
&alpha ;-eotaxine C-19 (CCL11) chèvre anti-rat, anticorps primaireSanta Cruz BTSC-6181
Anticorps secondaire conjugué à la phosphatase alcaline (AP)Dakopatts, DanemarkD0314
Anticorps secondaire biotinyléAmersham BiotechRPN1025
Complexe avidine-raifort-peroxydase (HRP) Sigma-AldrichA3151
Naphtol AS-MX phosphate (C19H18NO5P)Sigma-AldrichN4875-1GToxicité aiguë.
Sel Fast Blue RR, Azoïque Diazo n° 24 (C15H14ClN3O3 x 1/2 ZnCl2)Sigma-AldrichFBS25
Chlorhydrate de lévamisol (C11H13ClN2S)Sigma-Aldrich31742Toxicité aiguë.
Tétrachlorhydrate de 3,3'-diaminobenzidine (DAB Chromogen)DAKOS3000Hautement inflammable. Toxique.
Sulfate de cuivre (CuSO4)Merck1.02791Toxicité aiguë. Danger environnemental.
GelTol Milieu de montage aqueuxThermo Electron Corporation230100
Peroxyde d’hydrogène, 30 % (H2O2)Merck107210Toxicité aiguë.
Méthanol (CH3OH)Fluka65543Toxicité aiguë. Sensibilisation respiratoire. Cancérogénicité. Inflammable.
Tris (hydroxyméthyl) aminométhane, base TRIS (C4H11NO3 )AppliChemA1379Irritation de la peau et des yeux.
Tris Saline tamponnée (TBS), compriméSigma-AldrichT5030
Di- Hydrogénophosphate de sodium dihydraté (Na2HPO4 x 2H2O)Merck1.0658
Dihydrogénophosphate de sodium monohydraté (NaH2PO4 x 1H2O) Merck1.06346
Sérum de veau fœtal (FCS) Cambrex BioScienceDE-14-802F
DAKO tampon de lavage de cytomation 10x DAKOS3006Doit être conservé à 2-8 ° ; C pour inhiber la croissance bactérienne. Évitez la formation de mousse.
N,N-diméthylformamide ; DMF (C3H7NO)Fluka40250Inflammable. Toxicité aiguë.
lamelles en verre 24 x 36 mm Menzel-Glä ; serBB024036A1
Acide chlorhydrique, conc. (HCl)Sigma-Aldrich30721Corrosif, irritant, perméateur. Sensibilisant pulmonaire (sous forme de brouillard acide). Toxique.
Solution d’acide chlorhydrique volumétrique, 2 M HCl (2 N)Fluka71826Corrosif, irritant, perméateur. Sensibilisant pulmonaire (sous forme de brouillard acide). Toxique.
Nitrite de sodium, ReagentPlus, ≥ ; 99,0 % (NaNO2)Sigma-AldrichS2252oxydant. Toxique. Dangereux pour l’environnement.
Sel disodique de l’acide éthylènedinitrilotétraacétique dihydraté (EDTA ; C10H14N2Na2O8 x 2H2O)Merck1.08454L’exposition par voie orale peut avoir des effets sur la reproduction et le développement.
Equipment
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Références

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  1. Coons, A., Creech, H. J., Jones, R. N. Immunological properties of an antibody containing a fluorescent group. Proc Soc Exp Biol Med. 47, 200-202 (1941).
  2. Nakane, P. K., Pierce, G. B.

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Mots-clés

ImmunohistochimiePr paration des tissusR cup ration des antig nesMicroscopie optiqueEnrobage en paraffineGanglions lymphatiques p riph riquesAnticorps primairesAnticorps secondairesAvidine peroxydase de raifort

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