Génération de cardiomyocytes humains: Un protocole de différenciation des induits des cellules souches pluripotentes humaines chargeur sans

Résumé

Les cellules souches pluripotentes, cellules embryonnaires ou soit souches pluripotentes induites (iPS), constituent une précieuse source de cellules différenciées humaines, y compris les cardiomyocytes. Ici, nous allons nous concentrer sur l'induction de cellules iPS cardiaque, en montrant comment les utiliser pour obtenir des cardiomyocytes humains fonctionnels à travers un protocole corps à base embryoïde.

Résumé

Afin d'enquêter sur les événements de conduite développement du cœur et de déterminer les mécanismes moléculaires conduisant à des maladies du myocarde chez l'homme, il est essentiel d'abord de générer des cardiomyocytes humains fonctionnels (CMS). L'utilisation de ces cellules dans la découverte de médicaments et les études de toxicologie serait également très bénéfique, en permettant de nouvelles molécules pharmacologiques pour le traitement des troubles cardiaques être validées au stade clinique sur les cellules d'origine humaine. Parmi les sources possibles de la CMS, les cellules souches pluripotentes induites (iPS) sont parmi les plus prometteurs, car ils peuvent être directement dérivées de tissus du patient facilement accessibles et possèdent une capacité intrinsèque pour donner naissance à tous les types cellulaires de l'organisme ^1. Plusieurs méthodes ont été proposées pour la différenciation des cellules iPS en GC, allant des classiques des corps embryoïdes (EBS) approche agrégation des protocoles définis chimiquement ^2,3. Dans cet article, nous proposons un protocole EBS-base et montrons comment cette méthoD peut être utilisé pour générer efficacement des cellules CM-comme fonctionnels à partir de cellules iPS sans chargeur.

Introduction

Historiquement, l'étude des mécanismes génétiques et moléculaires de conduire le développement humain et la maladie a été basée sur la production de modèles de recherche génétiquement modifiés. Cependant, de nombreux phénotypes humains ne parviennent pas à être reproduit avec succès chez la souris, principalement en raison des différences biologiques existant entre les deux espèces. D'autre part, l'accès aux tissus humains peuvent être limitées et souvent ne permettent pas suffisamment de matière pour être obtenue pour des études expérimentales en profondeur. Le domaine de la biologie cardiovasculaire souffre de ces deux limites: la physiologie du cœur de....

Protocole

1. Entretien chargeur et sans repiquage des iPS humaines lignées cellulaires

1. Préparer les plats Matrigel revêtus. Décongeler une fiole de Matrix ESC qualifié humaine sur la glace pendant une heure et diluer dans 25 ml de milieu DMEM-F12. Ajouter 1 ml de chaque plaque de 35 mm (ou des quantités équivalentes par unité de surface si d'autres plats sont utilisés), tout garder sur la glace et faire en sorte que toutes les plaques et tubes sont pré-refroidi. Couvrir les plaques avec du papier d'aluminium.

Note: actions concentrations de Matrigel varient selon le lot. instructions de dilution sont indiqu....

Résultats

Dans nos études, nous avons généré CM de plusieurs lignées de cellules iPS. Ces lignes ont d'abord été générées sur une couche nourricière MEF mais ont été immédiatement placés sur Matrigel utilisant un milieu défini (soit mTESR1 ou Nutristem). Différents tests ont permis de vérifier l'entretien des propriétés morphologiques, l'expression de marqueurs typiques des cellules pluripotentes (Oct-4, SSEA4 et TRA1-60) et leur stabilité du génome (Figure 1).

L'inser.......

Discussion

Les cellules souches pluripotentes ont le potentiel de se différencier spontanément en GC, mais avec une faible efficacité et une forte variabilité entre les lignes. Le développement de nouvelles méthodes d'induction a donc mis l'accent sur l'amélioration de l'efficacité du processus et se déplaçant vers des protocoles plus définis. Cependant, la plupart de ces nouvelles méthodes de différenciation sont assez complexes, nécessitant des conditions complexes de la culture, le contrôle précis de la synchron.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Milieux et réactifs
Human ESC qualifié Matrix	BD Biosciences	354277	décongeler le flacon de 5 ml à 4 ° ; C sur glace O/N, aliquote dans des cryo-tubes pré-réfrigérés sur glace, selon les instructions de dilution de la fiche technique et stockage à -20 ° ; L .
Fibronectine, à partir de plasma humain, solution à 0,1 %	Sigma	F0896-2MG	Concentration de travail : 5 &mu ; g/cm2
Laminin	Sigma	L2020-1MG	Concentration de travail : 5 &mu ; g/cm2
PBS (sans Mg ni Ca), 10X	Lonza	BE17-515F
PBS (avec Mg et Ca), 10X	Bio Sera	XC-S2067/500
Dispase II, protéase neutre, grade II	Roche	4942078001	Stock : 10 mg/ml dans du DMEM-F12 à -20 ° ; C, solution de travail : 1 mg/ml dans du PBS (pas de Mg/Ca)
Trypsine/EDTA, 0,5 %	Sigma	T3924
Collagénase de type 2	Worthington	4176	Dilué à 480 U/ml (par exemple 1,6 mg/ml) dans du PBS avec Mg et Ca
DMEM-F12	Life Technologies	21331-020
Knockout DMEM	Life Technologies	10829-018
Sérum Knockout Remplacement (KSR)	Life Technologies	10828-028	Dégel à 4 ° ; C, aliquote et stockage à -20 ° ; C
F– ; tal Sérum bovin (origine Amérique du Sud)	Invitrogen	10270-106	Les lots doivent être testés pour leur potentiel cardiogénique. Décongeler à 4 ° ; C, inactivé par la chaleur à 56 °C C pendant 30 min, aliquote et conserver à -20 ° ; C
PenStrep, pénicilline-streptomycine, 100X	Life Technologies	15140-122
GlutaMAX, 100X	Life Technologies	35050-038
MEM NEAA, 100X	Invitrogen	11140-135
N2 supplément, 100X	Life Technologies	17502-048
B27 supplément, 50X	Life Technologies	12587-010
2-mercapt– ; thanol	Invitrogen	31350-010
Gélatine, à partir de peau de porc	Sigma	G1890-100G	Stocker à 1 % dans l’eau, stocker à -20 ° ;C. Diluer à 0,1 % dans PBS et conserver à 4 ° ; C
mTeSR1	Stem Cell Technologies	5850	Combinez le supplément 5X avec le milieu de base, aliquotez-le et stockez-le à -20 ° ;C. Ne pas maintenir le milieu complet à 4 ° ; C pour plus de 1 semaine
Nutristem hESC XF	Stemgent de Biological Industries	05-100-1A	Décongélation à 4 ° ; C O/N, aliquote et stockage à -20 ° ; C jusqu’à l’utilisation. Les aliquotes peuvent être maintenues à 4 ° ; C pour une semaine au plus.
mFreSR	Stem Cell Technologies	5853
Acide ascorbique	Sigma	A4544-25G	Préparer des stocks à 10 mg/ml dans de l’eau. Stocker les aliquotes à -20 ° ; C dans l’obscurité. Ajouter à l’EBM à la concentration finale (500X)
Plasticware
35 mm Boîtes de culture	Becton Dickinson	353001
Cell scraper	Corning Incorporated	3008
Plaques 12 puits	Becton Dickinson	353043
Permanox Lames de chambre 2 puits	Thermo Fisher Scientific	177437
Lames de chambre 2 puits en verre	Thermo Fisher Scientific	177380
Plaques 6 puits, surface d’attache ultra-faible	Corning Incorporated	3471
Aiguille 18G	Becton Dickinson	304622
Pipettes pasteur en verre, 230 mm	VWR International	612-1702
Seringue de 2,5 ml	Becton Dickinson	300188
Equipments
de travail FIV	KSystem, par Nikon
Nikon SMZ1500 Stéréomicroscope	Nikon

Station