A Caenorhabditis elegans Système modèle pour l'étude de Amylopathy

Résumé

Nous décrivons des méthodes pour étudier les aspects de amylopathies dans le ver C. elegans. Nous montrons comment construire vers exprimant Aß humain ₄₂ Dans les neurones et comment tester leur fonction dans des tests comportementaux. Nous montrons en outre comment obtenir cultures primaires de neurones qui peuvent être utilisés pour les tests pharmacologiques.

Résumé

Amylopathy est un terme qui décrit la synthèse anormale et l'accumulation de bêta-amyloïde (Aß) dans les tissus avec le temps. Aß est une caractéristique de la maladie d'Alzheimer (MA) et se trouve dans la démence à corps de Lewy, la myosite à inclusions et l'angiopathie amyloïde cérébrale ^1-4. Amylopathies développer progressivement avec le temps. Pour cette raison, les organismes simples avec une durée de vie courte peuvent aider à élucider les aspects moléculaires de ces conditions. Ici, nous décrivons les protocoles expérimentaux pour étudier la neurodégénérescence Aß induite par l'utilisation des Caenorhabditis elegans du ver. Ainsi, nous construisons vers transgéniques par injection d'ADN codant pour Aß humain ₄₂ dans les gonades syncytial des hermaphrodites adultes. Des lignées transformantes sont stabilisés par une intégration mutagenèse induite. nématodes âge synchronisée par la collecte et l'ensemencement de leurs oeufs. La fonction de neurones exprimant Aß ₄₂ est testé dans des essais comportementaux opportuns (essai de chimiotaxies). Cultures primaires de neurones obtenus à partir d'embryons sont utilisés pour compléter les données comportementales et de tester les effets neuroprotecteurs de composés anti-apoptotiques.

Introduction

bêta-amyloïde (Aß) est un peptide de 36 à 43 acides aminés qui est formé après clivage séquentiel de la protéine précurseur de l'amyloïde (APP) par β et γ ^d'une secrétases. La γ-sécrétase traite l'extrémité C-terminale du peptide Aß et est responsable de ses longueurs variables ^5. Les formes les plus courantes de Aß sont Aß ₄₀ et Aß _42, ce dernier étant le plus souvent associée à des états pathologiques tels que AD ^5. A des concentrations élevées Aß forme β-feuilles qui s'agrègent pour former des fibrilles amyloïdes ^6. Fibrilles dépôts sont la principale composante des plaques séniles autour des neurones. Les deux plaques et diffusables, les oligomères de Aß non-plaque, sont pensés pour constituer le sous-jacent pathogènes de Aß.

Etude en laboratoire des amylopathies neuronales est compliquée par le fait que ces conditions progrès avec le temps. Par conséquent, il est important de développer animaux génétiquement traitable modèles-complémentaire à des souris-avec durée de vie courte. Ces modèles peuvent être utilisés pour élucider les aspects spécifiques de amylopathies-général cellulaire et moléculaire et en raison de leur simplicité, de les aider à capturer l'essence du problème. Le ver Caenorhabditis elegans chutes est cette catégorie. Il a une durée de vie courte, ~ 20 jours et dans les processus cellulaires de base supplémentaires, y compris la régulation de l'expression génique, le trafic des protéines, de la connectivité neuronale, synaptogenèse, la signalisation cellulaire et la mort sont similaires à des mammifères ^7. Les caractéristiques uniques du ver comprennent la génétique puissants et l'absence d'un système de navire, qui permet d'étudier les lésions neuronales indépendamment des dommages vasculaires. D'autre part, l'absence d'un cerveau limite l'utilisation de C. elegans pour étudier de nombreux aspects de la neurodégénérescence. En outre, la reproduction et l'identification des distributions anatomiques des lésions ne peuvent être exécutées dans cet organisme. Autre limitetions comprennent la difficulté d'évaluer les différences dans les profils d'expression des gènes et des troubles du comportement complexe et fonction de mémoire. Nous décrivons ici les méthodes pour générer C. elegans modèles de amylopathies.

Protocole

1. Construction des vers transgéniques

1. Transformation.
   1. Préparer plaquettes d'injection. Déposer une goutte d'eau chaude, 2% d'agarose dissous dans l'eau, sur une lamelle de verre. Placer rapidement d'une seconde lamelle sur la goutte et tapoter sur elle. Après l'agarose est solidifié, des lamelles de diapositives à part, et cuire la lamelle-pad dans un four sous vide à 80 ° CO / N.
   2. Tirez pipettes. Nous utilisons une Sutter P-97 Extracteur de tirer 1/0.5 mm OD / ID borosilicate capillaires avec filament. Les pipettes sont forgés à pointe fermée qui est cassé ouvert à un stade ultérieur.
   3. Préparer le mélange d'injection. Faire le mélange d'injection contenant l'ADN d'intérêt (20 ng / l par construction) plus vide ADN plasmidique à une concentration finale de 150 ng / ul. Centrifuger le mélange d'injection pour éliminer tout contaminant. Cette étape est cruciale car les contaminants réduisent l'efficacité de la transformation. Transférer le top 5 pl (débris et autres contaminants s'accumulent dans le fond) dans un nouveau tube à be utilisé dans l'injection.
   4. Chargez mélange d'injection par capillarité. La partie inférieure de la pipette est immergée dans le mélange d'injection. Typiquement 0,5 pi sont suffisantes pour injecter 100 vers.
   5. Chargez pipette d'injection. Insérez la pipette sur le support du micromanipulateur et casser ouvert en frottant sa pointe contre le bord d'une lamelle montée sur une lame de verre ou encore contre les débris sur le pavé agarose. Il s'agit d'une étape cruciale que des conseils trop grand dommage que le ver et trop petits conseils sont facilement bouché. La qualité de la pointe cassée peut être jugée par la forme et surtout par le débit. Le débit peut être évaluée par la taille des bulles qui coule de l'extrémité ouverte immergé dans une goutte d'huile de 700 des halocarbures en réponse à une pression d'injection.
   6. Transfert vers de tampon d'injection. Déposer une goutte de 700 huile hydrocarbure, un tampon d'injection et de transférer plusieurs (1 ou 2 pour les débutants) vers à l'huile. Utilisez un ver choisir de pousser les vers le bas sur la touche jusqu'à ce que leY adhérer à l'agarose. Worms doivent être orientés en rangées avec des côtés ventrales dans la même direction. Évitez de toucher la tête de vis. Si après plusieurs tentatives les vers parviennent pas à adhérer à la garniture, le remplacer par un tampon frais ou augmenter agarose épaisseur et / ou la concentration.
   7. Insérer la pipette dans le ver. En déplaçant la scène, positionnez le ver sous la pipette. Positionner la pipette dans le noyau central de la gonade, car son cytoplasme est partagé par de nombreux noyaux des cellules germinales. Cela augmente la probabilité de livrer ADN injecté à de nombreux descendants. La pipette doit se trouver pratiquement parallèle à la vis sans fin (~ 15 ° -25 ° d'angle). Pousser verticalement la pointe de la pipette vers le bas du corps de la vis sans fin jusqu'à ce que la peau est enfoncée. Puis appuyez doucement sur le manipulateur pour induire l'insertion de pointe. Pour de meilleurs résultats injecter deux gonades.
   8. Injecter la solution d'ADN. Appliquer une pression à la pipette jusqu'à ce que la houle gonades. Arrêter l'écoulement et tirer le ver au large de la pipette. Testez l'aiguille pour le flux, puis déplacezà l'autre vis sans fin et les étapes d'injection de répétition.
   9. Récupérer les vers: Ajouter une goutte (~ 10 pi) de tampon de récupération sur les vers et incuber jusqu'à ce que les vers commencent la natation. Ajouter un volume égal de M9, attendre jusque vers reprendre la natation et répéter plusieurs fois jusqu'à ce que la solution est surtout M9. Transférer individuellement vers de plaques ensemencées.
2. Intégration.
   1. Placez 40 en bonne santé, bien nourris, L4 vers dans une assiette fraîche
   2. Irradier avec γ-ray avec 4000 rads pour 40 min. Transfert vers irradiés (P0), en OP50 plaques ensemencées frais (4 worms / plaque). Les vers peuvent également être irradiés avec une dose de 300 J / m ² UVs.
   3. Transfert 10-20 transformants F1 à partir de chaque plaque d'assiettes individuelles, étiqueter les plaques avec le P0 origine correspondant.
   4. Simple à 2-4 transformants F2 pour chaque F1 à plaques séparées. Vérifier la descendance F3 de transmission de 100% du marqueur de la transformation. Typiquement, 1-3% de la descendance d'une wil ver irradiéJe dois un événement d'intégration.
   5. Faire stocks de trois ou plusieurs lignes de transformants indépendants.

2. Tests comportementaux

1. Age-synchronisation.
   1. Croître vers de la norme 10 cm plaques NGM + OP50 E. coli jusqu'à une grande population d'adultes gravides est atteint (3-5 jours).
   2. Recueillir les vers dans des tubes de 50 ml Falcon en les suspendant dans un tampon M9 1 ml.
   3. Ajouter 5 ml tampon M9 et centrifuger à 450 g pendant 3 min. Rejeter le surnageant. Répétez 3-4x.
   4. A la fin de la dernière centrifugation, éliminer le surnageant et ajouter 10 volumes de solution d'hypochlorite de base (0,5 M NaOH, 1% d'hypochlorite fraîchement mélangé) pour les vers granulés. Incuber à température ambiante pendant ~ 10 min. La réaction de lyse peut être contrôlée en plaçant une goutte de la réaction de lyse sur une lamelle couvre-objet et en examinant les vers au microscope. Lorsque environ 80% des vers sont cassé la réaction doit être arrêté.
   5. Arrêter la réaction de lyse par Adding le même volume de tampon d'oeufs stériles.
   6. Ramassez les oeufs (et des carcasses) par centrifugation à 450 g pendant 5 min.
   7. Lavez les œufs avec le tampon d'œuf stérile 2-3x.
   8. L'incubation O / N dans un tampon M9 et les graines sur des plaques NGM standard.
2. Essai de chimiotaxie.
   1. Préparer plusieurs morceaux de gélose environ 0.5x0.5x0.5 cm. Nous déposons l'agar-agar dans une plaque de 10 cm et on coupe les morceaux de gélose à partir de là.
   2. Faire tremper le morceau de gélose dans une solution contenant l'attractif souhaité (à saturation, les concentrations quasi-saturation) pendant 2 heures. Attractifs typiques sont lysine (0,5 M), biotine (0,2 M).
   3. Déposez un morceau de gélose dans une plaque d'essai de 10 cm dans lequel l'emplacement d'un point de test et une tache de contrôle ont été marquées (figure 1A). Permettre l'équilibrage et la formation d'un gradient O / N (figure 1B). Préparer 5 plaques pour une expérience unique.
   4. Avant l'expérience, ajouter 10 ul de 20 mM _NaN3 (anesthetic) à chaque endroit.
   5. Placez 20 vers l'âge synchronisées dans le centre de la plaque. Placer la plaque dans l'incubateur à 20 ° C.
   6. Après 1 heure, compter les animaux sur les points de test / contrôle et de calculer l'indice de chimiotactisme (CI) comme suit: où N, N _essai et N _Cnt., indiquent le nombre total d'animaux, le nombre d'animaux dans les lieux d'essai et le nombre d'animaux à l'endroit de contrôle.

3. Primaire embryonnaire Culture cellulaire

1. Lyse vers tel que décrit dans l'âge de la synchronisation.
2. Arrêter la réaction de lyse en ajoutant le même volume de tampon d'œufs stériles et centrifuger à 450 g pendant 5 min. Jetez doucement surnageant en prenant soin de ne pas perdre oeufs granulés. Répétez 2 à 3 fois ou jusqu'à ce que le surnageant soit clair.
3. Reprendre oeufs granulés (et des carcasses) Dans un tampon d'oeuf stérile 2 ml et ajouter 2 ml de solution stérile de 60% de saccharose dans un tampon d'oeuf. Mélanger cette solution jusqu'à ce que les œufs sont complètement remises en suspension (comme ils ont tendance à former des amas sous centrifugation) à la main ou au vortex.
4. Centrifuger à 450 g pendant 15 min.
5. Soigneusement transférer surnageant (contenant les oeufs) dans un tube stérile. Jeter culot qui contient les carcasses et autres sous-produits de lyse.
6. Retirez le saccharose résiduel en remettant en suspension les oeufs dans un tampon d'oeuf et la centrifugation à 450 g pendant 5 min. Recueillir délicatement et jeter le surnageant. Répétez 3x.
7. Sous une hotte laminaire remettre en suspension les œufs culot dans un tampon d'œuf stérile contenant 1 U / ml chitinase à température ambiante pour digérer les œufs. Après 30 min de commencer à surveiller la réaction (sous un microscope de culture cellulaire inversée). Chaque lot de chitinase a une activité un peu différente. Typiquement, la digestion est terminée en 1 heure.
8. Quand environ 70-80% des œufs sont digérés par chitinase ajouter CM-15 (L-15 de culture cellulaire medium contenant 10% de sérum de veau foetal, 50 U / ml de pénicilline et 50 pg / ml de streptomycine). Dissocier les cellules à l'aide d'une seringue avec une jauge 27. Filtrer la suspension cellulaire avec un 5,0 um filtre pour éliminer les embryons intacts, des amas de cellules et de larves.
9. Pellet de la suspension cellulaire dissociée par centrifugation à 450 g pendant 15 min. Retirer le surnageant et remettre le culot dans un milieu de culture cellulaire CM-15.
10. cellules dissociées de plaque sur des lamelles de verre préalablement enduit avec de la lectine d'arachide (0,1 mg / ml) dissous dans l'eau. Remarque: les cellules doivent adhérer au substrat afin de se différencier.
11. Les cellules peuvent être conservés à température ambiante (16-20 ° C) dans l'air pendant plus de 2 semaines.

Résultats

Avec nos protocoles, nous étudions les effets de l'homme Aß ₄₂ oligomères sur la fonction neuronale ^8. Un fragment codant Aß humain ₄₂ et le signal de séquence codant pour un peptide artificiel de vecteur d'incendie pPD50.52 été amplifié à partir d'assemblage PCL12 ⁹ en utilisant des amorces qui introduisent un site d'une endonucléase de restriction Sma aux extrémités. Le fragment a été ensuite inséré dans une construction contenant une séquence promotrice 2.481 pb FLP-6

Discussion

Nous décrivons ici une approche combinée, pour étudier les aspects cellulaires et moléculaires de l'aide amylopathies C. elegans. Les avantages de cette approche sont les suivants: 1.) Faible coût C. elegans est maintenu dans un plat normale Petri ensemencées avec des bactéries, à la température ambiante. 2) génétique puissants. Les animaux transgéniques peuvent être obtenus en quelques mois et un large éventail de séquences promotrices est disponible pour conduire l'expression du gène désiré d...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
1. NGM
Sodium Chloride	Sigma-Aldrich	S5886	3 g
Gélose bactériologique	AMRESCO	J637	17 g
Bacto-peptone	AMRESCO	J636	2,5 g
Eau			Porter à 975 ml
Stérilisé par autoclavage, puis ajouter les éléments suivants et bien mélanger
Sulfate	de magnésiumSigma-Aldrich	M2643	1 ml de 1 M de stock
Chlorure	de calcium Sigma-Aldrich	C5670	1 ml de 1 M de stock
Cholestérol	Sigma-Aldrich	C3045	1 ml de 5 mg/ml de stock (dans de l’éthanol)
Tampon			de phosphate de potassium 25 ml de 1M de stock
2. Tampon phosphate de potassium
Phosphate de potassium monobasique	Sigma-Aldrich	P5655	108,3 g
Phosphate de potassium dibasique	Sigma-Aldrich	P3786	35,6 g
Eau			Porter à 1 L
Stérilisé par autoclavage
3. Tampon M9
Phosphate de potassium monobasique	Sigma-Aldrich	P5655	3 g
Phosphate de sodium dibasique	Sigma-Aldrich	S5136	6 g
Chlorure	de sodium Sigma-Aldrich	S5886 5	g
Sulfate de magnésium	Sigma-Aldrich	M2643	1 ml de 1 M de stock
Eau			Porter à 1 L
Stérilisé par autoclavage
4. Tampon pour œufs (pH 7,3, 340 mOsm)
Chlorure	de sodium Sigma-Aldrich S5886		118 mM
Chlorure	de potassium Sigma-Aldrich	P5405	48 mM
Chlorure de calcium	Sigma-Aldrich	C5670	2 mM
Chlorure	de magnésium Sigma-Aldrich	M4880	2 mM
HEPES	Fisher Scientific	BP310	25 mM
Eau			Porter à 1 L
Stérilisé par autoclavage
5. Milieu de culture CM-15
L-15	Gibco	11415	450 ml
Sérum fœtal de veau	Gibco	10437-028	50 ml
Pénicilline	Gibco	15140	50 unités/ml
Streptomycine	Gibco	15140	50 g/ml
Ajuster à 340 mOsm avec saccharose puis filtrer stérilement dans des flacons autoclavés et stocker à 4 ° ; C
6. Autres réactifs
huile d’halocarbure 700	Produits d’halocarbure	9002-83-9
5 &mu ; m Filtre à seringue Acrodisc	PALL Co.	4199
Chitinase	Sigma-Aldrich	C6137-5UN
Lectine (arachide)	Sigma-Aldrich	L0881-10MG
Hydroxyde de sodium	Fisher Scientific	S320
Lysine	Sigma-Aldrich	L5501
Biotine	Sigma-Aldrich	B4639
Solution d’hypochlorite	de sodiumSigma-Aldrich	425044
Azoture de sodium	Sigma-Aldrich	71289
Saccharose	Sigma-Aldrich	S0389