A<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Système modèle pour l&#39;étude de Amylopathy

Résumé

Nous décrivons des méthodes pour étudier les aspects de amylopathies dans le ver C. elegans. Nous montrons comment construire vers exprimant Aß humain ₄₂ Dans les neurones et comment tester leur fonction dans des tests comportementaux. Nous montrons en outre comment obtenir cultures primaires de neurones qui peuvent être utilisés pour les tests pharmacologiques.

Résumé

Amylopathy est un terme qui décrit la synthèse anormale et l'accumulation de bêta-amyloïde (Aß) dans les tissus avec le temps. Aß est une caractéristique de la maladie d'Alzheimer (MA) et se trouve dans la démence à corps de Lewy, la myosite à inclusions et l'angiopathie amyloïde cérébrale ^1-4. Amylopathies développer progressivement avec le temps. Pour cette raison, les organismes simples avec une durée de vie courte peuvent aider à élucider les aspects moléculaires de ces conditions. Ici, nous décrivons les protocoles expérimentaux pour étudier la neurodégénérescence Aß induite par l'utilisation des Caenorhabditis elegans du ver. Ainsi, nous construisons vers transgéniques par injection d'ADN codant pour Aß humain ₄₂ dans les gonades syncytial des hermaphrodites adultes. Des lignées transformantes sont stabilisés par une intégration mutagenèse induite. nématodes âge synchronisée par la collecte et l'ensemencement de leurs oeufs. La fonction de neurones exprimant Aß ₄₂ est testé dans des essais comportementaux opportuns (essai de chimiotaxies). Cultures primaires de neurones obtenus à partir d'embryons sont utilisés pour compléter les données comportementales et de tester les effets neuroprotecteurs de composés anti-apoptotiques.

Introduction

bêta-amyloïde (Aß) est un peptide de 36 à 43 acides aminés qui est formé après clivage séquentiel de la protéine précurseur de l'amyloïde (APP) par β et γ ^d'une secrétases. La γ-sécrétase traite l'extrémité C-terminale du peptide Aß et est responsable de ses longueurs variables ^5. Les formes les plus courantes de Aß sont Aß ₄₀ et Aß _42, ce dernier étant le plus souvent associée à des états pathologiques tels que AD ^5. A des concentrations élevées Aß forme β-feuilles qui s'agrègent pour former des fibrilles amyloïdes ^6. Fibrilles dépôts sont la principale composante des plaques sénil....

Protocole

1. Construction des vers transgéniques

1. Transformation.
   1. Préparer plaquettes d'injection. Déposer une goutte d'eau chaude, 2% d'agarose dissous dans l'eau, sur une lamelle de verre. Placer rapidement d'une seconde lamelle sur la goutte et tapoter sur elle. Après l'agarose est solidifié, des lamelles de diapositives à part, et cuire la lamelle-pad dans un four sous vide à 80 ° CO / N.
   2. Tirez pipettes. Nous utilisons une Sutter P-97 Extracteur de tirer 1/0.5 mm OD / ID borosilicate capillaires avec filament. Les pipettes sont forgés à pointe fermée qui est cassé ouvert à un stade ultérieur.
   3. Préparer le mélang....

Résultats

Avec nos protocoles, nous étudions les effets de l'homme Aß ₄₂ oligomères sur la fonction neuronale ^8. Un fragment codant Aß humain ₄₂ et le signal de séquence codant pour un peptide artificiel de vecteur d'incendie pPD50.52 été amplifié à partir d'assemblage PCL12 ⁹ en utilisant des amorces qui introduisent un site d'une endonucléase de restriction Sma aux extrémités. Le fragment a été ensuite inséré dans une construction contenant une séquence promotrice 2.48.......

Discussion

Nous décrivons ici une approche combinée, pour étudier les aspects cellulaires et moléculaires de l'aide amylopathies C. elegans. Les avantages de cette approche sont les suivants: 1.) Faible coût C. elegans est maintenu dans un plat normale Petri ensemencées avec des bactéries, à la température ambiante. 2) génétique puissants. Les animaux transgéniques peuvent être obtenus en quelques mois et un large éventail de séquences promotrices est disponible pour conduire l'expression du gène désiré d.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
1. NGM
Sodium Chloride	Sigma-Aldrich	S5886	3 g
Gélose bactériologique	AMRESCO	J637	17 g
Bacto-peptone	AMRESCO	J636	2,5 g
Eau			Porter à 975 ml
Stérilisé par autoclavage, puis ajouter les éléments suivants et bien mélanger
Sulfate	de magnésiumSigma-Aldrich	M2643	1 ml de 1 M de stock
Chlorure	de calcium Sigma-Aldrich	C5670	1 ml de 1 M de stock
Cholestérol	Sigma-Aldrich	C3045	1 ml de 5 mg/ml de stock (dans de l’éthanol)
Tampon			de phosphate de potassium 25 ml de 1M de stock
2. Tampon phosphate de potassium
Phosphate de potassium monobasique	Sigma-Aldrich	P5655	108,3 g
Phosphate de potassium dibasique	Sigma-Aldrich	P3786	35,6 g
Eau			Porter à 1 L
Stérilisé par autoclavage
3. Tampon M9
Phosphate de potassium monobasique	Sigma-Aldrich	P5655	3 g
Phosphate de sodium dibasique	Sigma-Aldrich	S5136	6 g
Chlorure	de sodium Sigma-Aldrich	S5886 5	g
Sulfate de magnésium	Sigma-Aldrich	M2643	1 ml de 1 M de stock
Eau			Porter à 1 L
Stérilisé par autoclavage
4. Tampon pour œufs (pH 7,3, 340 mOsm)
Chlorure	de sodium Sigma-Aldrich S5886		118 mM
Chlorure	de potassium Sigma-Aldrich	P5405	48 mM
Chlorure de calcium	Sigma-Aldrich	C5670	2 mM
Chlorure	de magnésium Sigma-Aldrich	M4880	2 mM
HEPES	Fisher Scientific	BP310	25 mM
Eau			Porter à 1 L
Stérilisé par autoclavage
5. Milieu de culture CM-15
L-15	Gibco	11415	450 ml
Sérum fœtal de veau	Gibco	10437-028	50 ml
Pénicilline	Gibco	15140	50 unités/ml
Streptomycine	Gibco	15140	50 g/ml
Ajuster à 340 mOsm avec saccharose puis filtrer stérilement dans des flacons autoclavés et stocker à 4 ° ; C
6. Autres réactifs
huile d’halocarbure 700	Produits d’halocarbure	9002-83-9
5 &mu ; m Filtre à seringue Acrodisc	PALL Co.	4199
Chitinase	Sigma-Aldrich	C6137-5UN
Lectine (arachide)	Sigma-Aldrich	L0881-10MG
Hydroxyde de sodium	Fisher Scientific	S320
Lysine	Sigma-Aldrich	L5501
Biotine	Sigma-Aldrich	B4639
Solution d’hypochlorite	de sodiumSigma-Aldrich	425044
Azoture de sodium	Sigma-Aldrich	71289
Saccharose	Sigma-Aldrich	S0389

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